Siglec-9对肿瘤发展的影响及在肿瘤靶向治疗和影像诊断中的应用

彭 燕，唐 奇综述，冯振卿审校

0 引 言

Siglec-9是唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素(sialic acid-binding immunoglobulin-like lectin，Siglec)家族的成员之一，通常表达于中性粒细胞、单核巨噬细胞、CD56+NK细胞，以及少量正常T细胞膜表面。Siglec-9通过识别含有唾液酸的糖链结构，参与细胞之间或细胞与病原体之间的相互作用，对机体先天性免疫和获得性免疫具有抑制作用。越来越多的证据表明，Siglec-9在肿瘤发展中具有重要作用，研究发现Siglec-9不仅可促进肿瘤的增殖侵袭转移以及新生血管的形成，还可负调控免疫微环境。这些发现给肿瘤治疗提供了一个新的靶点，近年来已逐步开展针对Siglec-9的肿瘤免疫治疗。本文将对Siglec-9的结构、生物学功能以及在肿瘤靶向治疗和影像诊断中的作用作一综述。

1 Siglec-9的基本结构与功能

1.1 Siglec-9的基本结构Siglecs按序列保守程度可分为两大类：一类是序列可变的CD33相关性Siglecs，另一类是序列保守的经典型Siglecs。人源Siglecs有15种，CD33相关性Siglecs包含有Siglec-3、Siglec-5、Siglec-6、Siglec-9等11种，经典型Siglecs分别是Siglec-1、Siglec-2、Siglec-4以及Siglec-15等4种。鼠源Siglecs有9种，其中CD33相关性Siglecs包括Siglec-3，Siglec-E、Siglec-F、Siglec-G以及Siglec-H，经典型Siglecs同人源的4种类型一样，并且Siglec-E与人源性Siglec-9属于同源物，常用Siglec-E替代研究Siglec-9的功能[1]。

Siglec-9基因位于人19号染色体，由七个外显子和六个内含子组成，编码区含有1392个核苷酸。Siglec-9是Siglec-9基因编码的单次I型跨膜蛋白，含463个氨基酸，分子量大小为50 Kda左右，特异性表达于髓系细胞和免疫细胞的细胞膜表面[2-3]。Siglec-9胞外区包含3个Ig样结构域，分别是1个V-set Ig样结构域和2个C2-set样结构域[2]。其中V-set结构域对于识别唾液酸具有重要作用，它包含两个对识别唾液酸有重要影响的氨基酸残基，分别是β链中的精氨酸和色氨酸，这些残基可分别与唾液酸的羧基和甘油状侧链直接相互作用[4]。胞质区内有两个保守的含酪氨酸的基序，分别是基于酪氨酸的免疫受体抑制基序(immune receptor tyrosine - based inhibitory motif, ITIMs)和SLAM样基序。其中ITIM与信号转导有关，磷酸化后可招募酪氨酸磷酸酶SHP-1和SHP-2,调节机体的天然免疫和获得性免疫。此外，膜近端基序的突变还可增加Siglec-9的唾液酸结合活性[5]。

1.2Siglec-9的生物学功能中性粒细胞上Siglec-9的表达较高，作为抑制性唾液酸受体，可调节中性粒细胞死亡。研究表明Siglec-9可对磷脂酰丝氨酸再分配并加速DNA的裂解，其表达与中性粒细胞的自发性凋亡呈正相关。且在促炎因子GM-CSF、IFN-S、IFN-γ的作用下，Siglec-9还可介导中性粒细胞的自噬性死亡，细胞发生胞质空泡化，线粒体肿胀等改变[6-7]。

Siglec-E和Siglec-9是不同种属间结构相似，功能相同的直系同源物，主要表达于小鼠中性粒细胞和巨噬细胞表面。当中性粒细胞上的β整合素与纤维蛋白原或其他β整合素配体连接后，Siglec-E会与β整合素配体上的唾液酸以唾液酸依赖的方式相结合，与配体结合后的Siglec-E可能对β整合素下游信号通路产生影响，如抑制Syr Tyr317的磷酸化和p38 MAPK的激活以及激活β整合素触发的Akt和产生活性氧(reactive oxygen species, ROS)，从而正向调节还原型辅酶Ⅱ氧化酶的活性和ROS的产生[8]。ROS作为抗炎因子可抑制中性粒细胞的迁移和募集，保护炎症组织免受中性粒细胞过度募集造成的损伤，故而Siglec-9表达水平的增加对于如慢性阻塞性肺疾病、慢性鼻炎等炎症的控制具有积极作用[9-10]。此外，Siglec-E还参与脂多糖刺激引起的TLR4反应负调控以及大肠杆菌诱导的TLR4内吞[11]。

TCR是T细胞表面受体，通过识别特异性抗原肽，引起下游信号通路的活化。Siglec-9仅在少数T细胞亚群中表达，与Siglec-9配体结合后，会对TCR信号产生负调控。在TCR受到刺激后可增强Siglec-9的酪氨酸磷酸化以及ITIM基序对SHP-1的招募，降低ZAP70上319位酪氨酸的磷酸化，从而导致钙离子内流减少和活化T细胞核因子转录活性降低，抑制T细胞的活化[12]。Siglec-9除了促进细胞凋亡，调节细胞迁移和活化外，还可通过ITIMs基序促进巨噬细胞分泌抗炎因子IL-10，减少促炎因子的生成[13]。

Siglec-9还可调节Treg/Th17细胞的生成来介导自身免疫性疾病的发生发展[14]。在自身免疫性疾病中Treg细胞具有保护性作用，Th17细胞则通过诱导各种促炎因子反而加重疾病。而Siglec-9可通过诱导Treg细胞的形成，抑制Th17细胞，进而改善自身免疫性疾病如类风湿性关节炎的炎症反应，减轻关节软骨和骨的损伤[15]。

2 Siglec-9对肿瘤生物学特性的影响

2.1 Siglec-9对肿瘤增殖和侵袭转移的影响MUC1粘蛋白简称MUC1,是1型跨膜糖蛋白，其蛋白结构域高度O-糖基化，以丝氨酸和苏氨酸残基为特征[16]。MUC1在正常上皮细胞中广泛存在，并起保护作用，而在乳腺癌、胰腺癌等大多数腺癌中MUC1的O-糖链会发生异常糖基化改变，O-糖链由长支链变成多个唾液酸化短链, 研究发现唾液酸化短链的形成与癌组织内唾液酸基转移酶增加有关，在α-2,3唾液酸基转移酶和α-6唾液酸基转移酶的作用下，Tn糖抗原和T糖抗原会发生唾液酸化，形成STn和ST。其中STn的高表达可促进肿瘤的迁移和转移能力，是低分化腺癌和粘液癌的标志，而ST可与免疫抑制受体Siglec-9结合[17-18]。与其他Siglec-9配体不同的是，MUC1-ST并未促进ITIM基序的磷酸化，而是通过诱导钙通量激活MEK-ERK信号通路，促进与肿瘤相关因子的分泌，如与肿瘤侵袭、转移及新生血管形成相关的PAI-1[17,19]。除分泌因子外，Siglec-9与MUC1结合还触发对β-catenin的募集，随后β-catenin通过MUC1从细胞质转运到细胞核[20]。β-catenin作为转录共激活因子，可增加细胞周期相关基因Cyclin D1和c-Myc的表达，导致肿瘤细胞的增殖以及新生血管的形成，进一步促进肿瘤的恶性转化[21-22]。此外，Siglec-9与MUC1结合还可抑制gsk-3β对β-catenin的磷酸化，从而可能维持β-catenin的稳定，进而促进恶性表型的形成[20]。但是有趣的是，另有文献报道，Siglec-9的可溶性形式(sSiglec-9)可通过竞争性抑制MUC1与Siglec-9的结合,进一步避免负向免疫调节和/或抑制肿瘤相关的MUC1下游信号转导以及随后的肿瘤增殖，从而发挥抗肿瘤作用[23]。除了上述MUC1之外，还发现Siglec-9可与卵巢癌高表达的MUC16结合，作为粘附分子，MUC16还可能促进卵巢癌的腹膜转移[24]。

2.2Siglec-9对肿瘤免疫微环境的调节MUC1与巨噬细胞上的Siglec-9结合，可促进肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophage,TAMs)的形成，TAMs能够抑制CD8+T细胞的增殖，过表达IL-10以抑制树突状细胞分泌IL-12。此外，TAMs还可诱导FoxP3 Treg细胞的形成进一步参与对肿瘤免疫的负调控。免疫抑制分子IDO、PD-L1也表达上调，不仅抑制T细胞的活化和增殖，还促进T细胞凋亡，为肿瘤的发展营造有利的微环境[17,25-26]。其次，Siglec-9还高表达于NK细胞表面，作为细胞表面抑制性受体可与肿瘤表面的唾液酸碳水化合物结合，抑制NK细胞的激活和对肿瘤的杀伤活性[27]。除负调控NK对肿瘤细胞的杀伤活性外，Jandus等[27]还发现相比Siglec-9-NK细胞，Siglec-9+NK细胞高表达趋化因子受体CXCR1和CX3CR1,对IL-8的趋化倾向更为显著。而IL-8对肿瘤的增殖、侵袭以及新生血管的形成具有促进作用[28]。

Siglec-9在外周血T细胞上的表达很少，但在非小细胞肺癌、结直肠癌和卵巢癌患者肿瘤浸润性T细胞上的表达显著增加，与肿瘤细胞表面唾液聚糖结合可抑制TIL的激活，与患者的存活率成负相关[29]。在黑色素瘤中也存有相似情况，Siglec-9可抑制记忆性CD8+T细胞的TCR信号传导，降低细胞毒性并下调IFN-γ和TNF-α等细胞因子的表达[30]。

综上，有理由认为Siglec-9的表达对肿瘤的免疫微环境具有负调控作用，进而促进肿瘤的发展。

2.3Siglec-9对免疫监视的调控Siglec-9作为免疫细胞膜表面的抑制性受体，与恶变细胞膜表面的唾液酸残基结合，不仅能够直接抑制免疫细胞的毒性，如NK细胞以及CD8+T细胞等，还促进免疫抑制分子的表达，削弱体内免疫系统的监视功能。而且对于糖基化程度很高的MUC，Siglec-9还可诱导肿瘤细胞的生长[20,27,29-30]。未成熟树突状细胞(immature dendritic cells,iDCs)具有很强的抗原吞噬能力，而相比成熟DCs来说，iDCs中Siglec-9的表达明显上调，与癌细胞表面的唾液酸残基结合会导致IL-12的表达降低，抑制Th1细胞的免疫应答以及IFN-γ、TNF-α等因子分泌[31-32]。这些结果表明，Siglec-9对肿瘤免疫微环境的改变促使肿瘤逃避免疫监视，而对肿瘤细胞的促生长作用则又进一步使得肿瘤发生免疫逃逸。

此外，Siglec-9还可诱导癌细胞中的钙蛋白酶激活来促进粘着斑激酶以及一些信号蛋白如Akt9、paxillin等发生降解，从而调节癌细胞的粘附动力学，提高癌细胞的迁移和侵袭特性，增加癌细胞的活力和存活率。所以，这可能是癌细胞逃避免疫监视的另一种途径和机制[33]。

3 Siglec-9在肿瘤靶向治疗和影像诊断中的作用

3.1 Siglec-9单抗与免疫检查点抑制剂联合治疗近年来，随着精准医疗的兴起，免疫检查点抑制剂已逐步成为当前比较热门的一种癌症治疗方法。与单纯化疗相比，PD-1或PD-L1单抗可显著延长肺癌患者的生存期[34]。然而，绝大多数患者常由于耐药性的产生而导致疗效不佳[35]。因此针对单一免疫检查点抑制剂治疗的弊端，有学者提出联合治疗的策略。联合疗法是提高患者免疫应答率和预后的一种良策[36]。研究表明，靶向Siglec-9/唾液酸可提高抗肿瘤免疫力，故可将该通路作为T细胞激活用于免疫治疗的潜在靶点。由于CD8+TIL上除Siglec-9的表达外，还包括PD-1、TIM-3、LAG3等几种抑制性受体共表达，故可考虑将抗Siglec-9单价抗体与抗PD-1抗体等多种免疫检查点抑制剂联合应用，有望提高临床肿瘤患者的缓解率和预后[29,37]。

3.2抗体药物偶联物的治疗有研究发现将重组唾液酸酶与人表皮生长因子受体2 (human epithelial growth factor receptor-2,HER2)特异性抗体曲妥珠单抗偶联，可增强对乳腺癌细胞的杀伤。在几个HER2+乳腺癌细胞系中，观察到曲妥珠单抗-唾液酸酶偶联物可成功去除癌细胞表面Siglec-7和Siglec-9的配体，减少自然杀伤NK细胞与肿瘤表面配体相结合，并增强NKG2D的结合[38]。NKG2D是固有免疫系统中一个重要的激活性受体,它能识别靶细胞表面配体来传递活化信号，激活免疫系统，从而对靶细胞发挥杀伤作用。与单用曲妥珠抗体相比，抗体-唾液酸酶复合物增强了NK细胞对肿瘤细胞的杀伤，通过阻止抑制性Siglec受体/配体相互作用和刺激ADCC进一步增强其细胞毒作用[38]。因此，将曲妥珠单抗与唾液酸酶联合应用是一很有前景的癌症免疫治疗方法。

3.3基于聚糖抑制剂的治疗由于医疗技术的飞速发展，纳米材料在肿瘤生物诊断和治疗方面已有相关应用。利用纳米粒子向黑色素瘤细胞靶向递送唾液酸转移酶抑制剂3Fax-Peracyl Neu5Ac，不仅降低肿瘤细胞表面的唾液酸化，增加免疫细胞向肿瘤的浸润，还可大大提高靶向释药的剂量和精准度以及降低肾毒性等毒副反应[39]。此外，Büll等[40]发现向小鼠瘤体内注射唾液聚糖生物合成抑制剂Ac53FaxNeu5Ac，不仅可阻断黑色素瘤以及神经母细胞瘤中唾液聚糖的表达，还可增加肿瘤微环境中NK细胞和CD8+T细胞的数量，增强CD8+T细胞的细胞毒性，并且降低Treg细胞和MDSC细胞的生成，从而抑制肿瘤的生长。

3.4Siglec-9在影像学方面的应用除肿瘤靶向免疫治疗外，Siglec-9还可用于临床影像学诊断。正常状况下血管粘附蛋白-1储存于内皮细胞颗粒中，一旦出现炎症，会迅速转移到内皮细胞表面，可与Siglec-9发生特异性结合。研究发现，这一特性可用于炎症和肿瘤的PET成像[41]。68Ga-DOTA-Siglec-9是通过螯合剂DOTA结合68Ga对Siglec-9肽(由Siglec-9中的 283-297残基组成，此处以Siglec-9肽统称)进行标记获得的，它是由二硫键桥联的小分子环肽，可用于早期滑膜炎的诊断[42]。此外，还可用于动脉粥样硬化、急性呼吸窘迫综合症以及伯氏杆菌感染所致的关节炎检测等[43-45]。之前常用的[18F]FDG PET成像主要是依赖炎症细胞的糖酵解活性，缺乏特异性，易造成假阳性，但18F在空间分辨率上要优于68Ga，故有研究者设计出[18F]AlF-NOTA-Siglec-9这一替代性放射示踪剂，试验发现其在空间分辨率和放化程度以及摩尔活度上皆具有较好表现[46]。

4 结语与展望

Siglec-9是免疫细胞膜表面的抑制性唾液酸受体，可负调控肿瘤免疫微环境促进肿瘤的免疫逃逸，并且诱导肿瘤细胞增殖、转移以及新生血管形成，进一步促进肿瘤的恶性转化。目前已逐步开展针对Siglec-9这一靶点的肿瘤靶向免疫治疗，如联合其他免疫检查点抑制剂以及将唾液酸酶与其他抗体偶联等治疗手段。未来还可将针对唾液酸/Siglec-9通路的单克隆抗体与化疗药物、生物毒素相结合制备“生物导弹”定向杀灭癌细胞，减少肿瘤药物不良反应；还可辅以放疗，进一步加大对癌细胞的杀伤。并且还可制备出双特异性抗体，分别针对免疫细胞如NK细胞或T细胞表面的Siglec-9和肿瘤细胞表面抗原，这样能够大大增强NK细胞和T细胞的细胞毒性，提高疗效。此外，通过基因敲除的方法，定向敲除与肿瘤免疫逃逸相关的免疫细胞Siglec-9的表达，进而发挥抗肿瘤作用，还有待于进一步探索研究。