颗粒酶A 及其相关疾病的研究进展

牛荣威 综述 杨 敏, 审校

1.广州医科大学附属广州市妇女儿童医疗中心消化科（广东广州 510120）；2.广东省医学科学院 广东省人民医院（广东广州 510080）

颗粒酶（granzymes，Gzms）是一类丝氨酸蛋白酶，主要由自然杀伤（nature killer，NK）细胞及细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocytes，CTLs）分泌，主要功能为诱导细胞凋亡[1]。迄今为止在人体中共发现了5种Gzms（A、B、H、K、M），而在小鼠中发现10种Gzms（A、B、C、D、E、F、G、K、M、N）。既往对于颗粒酶的研究主要集中于GzmB在细胞凋亡中的作用，发现其在Gzms诱导细胞凋亡过程中起主导作用。GzmA作为含量最丰富的颗粒酶，其诱导细胞凋亡能力仅次于GzmB，而某些鱼类的GzmA 诱导细胞凋亡能力则强于GzmB[2]。近年来，越来越多的研究发现，GzmA除了诱导程序性细胞死亡外，还在炎症过程、自身免疫性疾病及肿瘤的发生发展中发挥重要作用。

1 GzmA的一般特性

1.1 GzmA的合成与调控

GzmA 的结构类似于胰蛋白酶，切割位点位于精氨酸或赖氨酸之后，GzmA基因在人类及小鼠中分别位于5 号及13 号染色体，相对分子质量为52 000[3]。Gzms在体内的合成与释放都需要经过一系列相同的步骤。Gzms首先被合成为无活性的前体分子，前体分子中包含分选信号及N-末端二肽，在分选信号的引导下前体分子被引导入内质网中加工。前体分子的N-末端二肽只能被细胞毒性颗粒中组织蛋白酶C（cathepsin C）分解，才能激发颗粒酶活性[4]。研究报道，组织蛋白酶C缺陷导致颗粒酶不能激活，与Papillon-Lefèvre综合征（亦称为掌跖角化-牙周破坏综合征）发病相关[5]。当杀伤细胞识别特定的靶细胞时，杀伤细胞释放细胞毒性颗粒进入与靶细胞之间形成的免疫突触中，Gzms 通过细胞毒性颗粒中的穿孔素（peforin，PFN）进入靶细胞，激活胞内特定的信号转导通路从而发挥作用[6]。Gzms 在体内发挥作用受丝氨酸蛋白酶抑制剂Serpin家族的调控，Serpinb6b和Serpinb12能够抑制外周循环中的GzmA[7-8]。

1.2 GzmA与细胞凋亡

细胞凋亡（apoptosis）是程序性细胞死亡的一种。既往研究发现，Gzms 的主要功能为诱导细胞凋亡，不同Gzms 诱导细胞凋亡所涉及的信号通路不完全一样。GzmB 作用于线粒体产生细胞色素c，激活caspase 依赖途径导致细胞凋亡[1]。而GzmA 主要通过非caspase 途径诱导细胞凋亡，通过PFN 进入靶细胞内的GzmA 在热休克蛋白（heat shock protein，HSP）70和HSP 90帮助下穿过线粒体膜，进入线粒体基质GzmA 蛋白水解电子传递链（electron transport complex，ETC）中的NADH 脱氢酶（泛醌）铁硫蛋白3（NADH dehydrogenase [ubiquinone] ferrithionein 3，NDUFS3），干扰线粒体的正常代谢功能，从而导致活性氧（reactive oxygen species，ROS）产生，通过ROS诱导内质网相关SET复合物易位到细胞核，SET复合物释放的NM23-H1和TREX-1两种核酸酶能引起单链DNA损伤，从而导致细胞凋亡[3]。ETC结构和功能的完整性在GzmA诱导ROS的产生中起重要作用，当用鱼藤酮抑制ETC时，GzmA诱导ROS产生以及细胞凋亡将会被抑制，另外当NDUFS3的水解位点突变时，ROS的产生以及细胞凋亡也会被抑制[3]。GzmA还可作用于DNA 双链修复蛋白Ku 70，影响受损DNA 的修复[9]。

1.3 GzmA与细胞焦亡

细胞焦亡是近年来才发现的由Gasdermin所介导的程序性细胞死亡方式[10]。与细胞凋亡不同的是，细胞焦亡过程伴随着炎症发生，是一种促炎形式的细胞死亡[11]。既往认为，细胞焦亡的完成依赖于caspase活化[12]。但最近研究发现，NK 细胞分泌的GzmA 通过穿孔素进入靶细胞内，蛋白水解Gasdermin B 从而诱导细胞焦亡过程的发生，而且该过程不涉及caspase的活化[13]。进一步研究证实，该过程还能够增强机体抗肿瘤能力[13]。

1.4 GzmA的灭菌能力

人类生活在充满病原体的环境中，机体的免疫系统可以抵御病原体入侵。人类NK 细胞以及CTLs分泌的细胞毒性颗粒中还包含一种叫颗粒溶素（granulysin，GNLY）的蛋白[14]，其能帮助Gzms杀灭宿主细胞内的细菌及寄生虫。Gzms 和GNLY 可以通过PFN 形成的孔道进入被细菌感染的细胞内，Gzms借助GNLY 进入胞内的细菌体内后作用于ETC 产生ROS，通过ROS诱导细菌快速死亡[15]。该过程可以通过杀死宿主细胞内的细菌来增强机体的抗菌能力，而不是直接诱导宿主细胞死亡来减少细菌的复制。Gzms杀灭宿主细胞的寄生虫过程与细菌相似，Gzms在PFN及GNLY的帮助下分别穿过细胞膜及寄生虫膜，诱导寄生虫产生ROS，摧毁其氧化防御系统，从而导致寄生虫死亡[16]。在此过程中，胞内寄生虫会先于宿主细胞死亡，这能限制寄生虫的进一步传播。

2 GzmA与感染性疾病

2.1 GzmA诱导巨噬细胞分泌TNF-α抑制结核杆菌生长

研究发现，结核病患者血清中的Gzms 和PFN水平低于健康人[17]。结核活动期与潜伏期血清中的GzmA水平较正常人显著下降，而且活动期下降的更加明显[18]。检测血清中GzmA浓度可能为结核的诊断及鉴别带来帮助。γ9δ2 T细胞对包括结核分枝杆菌在内的病原微生物有很强的抑制作用，而人们既往对于具体机制尚不清楚。最近研究发现，其抑制作用与γ9δ2 T细胞产生的GzmA有关。GzmA诱导巨噬细胞产生TNF-α，通过TNF-α 抑制结核杆菌生长，并且GzmA水平与细胞内分枝杆菌生长抑制之间存在高度显著的相关性，敲除GzmA 将会损害γ9δ2T 细胞对结核杆菌的生长抑制作用[19]。

2.2 GzmA诱导巨噬细胞分泌IL-6和TNF-α等细胞因子影响脓毒症的发生发展

细菌性脓毒症的发生与细菌侵入机体导致大量炎症因子释放有关。GzmA能刺激成纤维细胞和上皮细胞释放促炎细胞因子IL-6和IL-8[20]，还能促进巨噬细胞产生IL-6[21]，提示GzmA在脓毒症的发生中起一定的促进作用。小鼠实验发现，敲除GzmA 的小鼠感染布鲁菌发生脓毒症时，小鼠的存活率会明显上升，进一步研究证实这主要与NK细胞产生的GzmA刺激IL-1a、IL-1b、TNF-a、IL-6等炎症因子的生成减少有关[22]。腹膜炎是诱发脓毒症的重要原因之一。研究发现，继发于腹膜炎的脓毒症患者血清中GzmA明显升高[23]，提示GzmA在这一病理中起重要作用。进一步研究发现，血中升高的GzmA将会诱导巨噬细胞产生IL-6和TNF-α等促炎因子，加重脓毒症的发展。当在小鼠实验中使用Serpinb6b抑制GzmA的功能时,脓毒症小鼠的生存率明显升高[23]。是否可以通过使用GzmA的拮抗剂减少某些细胞因子的产生，达到预防脓毒症的发生以及减缓败血症的发展有待进一步研究。

2.3 GzmA影响病毒复制

CD4+T 细胞是人体感染艾滋病病毒后被攻击的主要免疫细胞，其数目及功能对评估治疗效果及患者免疫功能具有重要意义。研究发现，艾滋病早期血中HIV 特异性CD4+T 细胞所表达的GzmA 越高，CD4+T 细胞数目维持在正常范围的时间越长，且血中HIV 滴度越低[24]。说明GzmA 对控制病毒复制具有重要作用，这或许能为评估艾滋病的治疗效果提供重要工具。另一项研究发现，当感染奇昆古尼亚病毒（chikungunya virus）后，患者血中GzmA浓度会明显升高，并且血中的病毒滴度和疾病评分与GzmA升高的水平相关[25]。以上研究说明GzmA能够抑制某些病毒的复制,但其具体的机制需要进一步研究。

3 GzmA与非感染性疾病

3.1 GzmA 通过诱导破骨细胞分化影响类风湿性关节炎的发生发展

类风湿性关节炎（rheumatic arthritis，RA）是一种自身免疫性疾病，与破骨细胞被促炎细胞因子过度活化有关[26]。破骨细胞由骨髓内未成熟的前体细胞转化而来，前体细胞可以分泌TNF-α，促进自身成熟转化为破骨细胞[27]。研究发现，GzmA可促进前体细胞TNF-α mRNA的表达，进而促进破骨细胞分化，在一定程度上可加重RA的病情[28]。IFN-γ、IL-6、IL-17、TNF 等促炎因子在RA 患者的血清中明显升高，而在敲除GzmA 的RA 小鼠中发现，这些促炎因子在血清中的浓度明显下降，证明这些促炎因子是GzmA刺激细胞释放的来源之一[28]。敲除或阻断GzmA的作用，或许能够缓解RA的发生及发展，这为RA的治疗带来新的靶点。

3.2 GzmA通过调节IFN-I的表达影响1型糖尿病的发生

研究发现，GzmA缺陷可能也是1型糖尿病（type 1 diabetes，T1D）的易感因素之一，因为在T1D患者血清中发现，其T细胞表达的GzmA明显下降，并且在动物实验中证实，缺乏GzmA时，T1D的发生率会明显上升[29]。在另一项研究中，实验人员敲除非肥胖糖尿病小鼠的GzmA 基因发现，小鼠胰岛中IFN-I 调节基因的表达与对照组相比明显上升，IFN-I 能够激活小鼠体内的T 细胞，打破免疫耐受，导致胰岛β 细胞被破坏[30]。同时，GzmA缺乏导致胰岛及脾脏中的树突状细胞和NK 细胞单链DNA 异常积累。单链DNA作为一种内源性信号，也能够刺激局部IFN-I的产生，进一步加重胰岛的破坏[30]，但具体的信号通路有待进一步研究证实。

3.3 GzmA激活肠癌细胞pSTAT3，促进肠道炎症及结直肠癌的发展

溃疡结肠炎（ulcerative colitis，UC）是一种慢性非特异性炎症性疾病，病变主要累及结肠以及直肠，临床表现为持续或反复发作的腹痛、腹泻、黏液血便、里急后重和不同程度的全身症状。研究发现，结肠组织中GzmA的表达受CD4+T细胞调控，UC患者结肠细胞中GzmA水平较正常人升高[31]。临床研究发现，在etrolizumab 单抗治疗的UC 患者中，高水平的GzmA与UC的临床缓解及黏膜愈合呈正相关[32]。一项关于UC患者罹患结肠癌的队列研究发现，与正常人相比，UC患者罹患结肠癌的风险明显增加[33]。动物实验发现，细胞外GzmA 能够诱导巨噬细胞产生IL-6，激活结肠癌细胞中的pSTAT3信号，间接促进肠道炎症以及结直肠癌的发展[21]。当使用Serpin 6 b 拮抗GzmA的作用或敲除GzmA 后，肠炎小鼠结肠中的IL-6、TNF-α等炎症因子水平明显下降，小鼠的肠道炎症明显减轻并且大大减缓结肠癌的发展[21]。拮抗GzmA的作用可能成为UC以及结肠癌的新治疗靶点。

综上，目前研究表明GzmA介导细胞凋亡和细胞焦亡，诱导炎症因子释放，参与机体抵御致病菌感染，并与某些自身免疫性疾病及结肠肿瘤的发生有关，病理生理学机制尚未完全了解。GzmA在不同疾病中的作用机制不同，其血清或组织中的表达水平不同，GzmA表达水平对疾病的诊断和疗效评估作用有待进一步研究。激活或抑制GzmA 与疾病发生进展相关，使用GzmA激动剂或抑制剂可能为疾病防治带来新的靶点。