3D打印丝素蛋白/聚乙烯醇/纳米羟基磷灰石支架体内降解的研究

李 蕾，刘小元，张 凯，韩祥祯，周琦琪，何惠宇

颌面部较大骨缺损是目前世界上较为普遍的临床问题之一，大部分颌面部骨缺损修复在临床上仍然需要骨移植或使用骨替代材料[1-2]。支架材料除了具有促进成骨能力外，还应有一定的降解性能，因此可降解支架是目前骨组织工程的研究热点。丝素蛋白相关支架在骨缺损处的降解除了与机体的免疫有关外，还与支架所处骨缺损处的骨改建过程密不可分，骨再生过程中骨的形成和吸收保持一定的平衡，这一过程较为复杂，由多种通路、多种因子参与。巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor，M-CSF)有利于破骨细胞的运动和扩散。骨吸收过程中钙调磷酸酶/活化T细胞核因子(calcineurin/nuclear factor of activated T cells，CN/NFAT)通路也发挥重要作用，有研究发现活化T细胞核因子1(nuclear factor of activated T cells1, NFATc1)在破骨细胞形成过程中有一定的调节作用[3]。而在骨改建的过程中，除了NFATc1，白细胞介素-1(interleukin-1，IL-1)、白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、M-CSF等因子也与破骨细胞相关。因此我们将膜片包裹的支架植入动物体内，观察支架在体内以及其周围组织的变化，并检测与支架降解相关的因子，观察两种不同支架之间降解相关因子表达的不同，比较两种支架的降解性能。

1 材料与方法

1.1 实验动物

10 kg左右的4～6月龄阿勒泰大尾羊2只、(35.52±1.20)kg的12月龄阿勒泰大尾羊12只，雌雄不限。在新疆医科大学动物中心(编号：IACUC20170706-04)圈养。实验过程中参照相关动物伦理学标准的条例对实验动物进行处置。

1.2 实验材料

20 nm 羟基磷灰石(南京埃普瑞公司，中国)；碳酸钠(分析纯)、溴化锂(分析纯)、蚕茧、电子天平(Sartorius BSA124S)(新疆医科第一附属医院提供)；三维打印成型机(新疆大学)，超净工作台(苏州净化设备厂)；α-MEM培养液(Hyclone，美国)；速眠新、新速醒、戊巴比妥(天津化学试剂，中国)；舒泰®50(Virbac S.A，法国)；荧光定量PCR仪(Bio-Rad CFX96，美国)；SF/PVA/n-HA支架、PVA/n-HA支架(新疆大学、新疆医科大学)。

1.3 实验方法

1.3.1 3D打印 SF/PVA/n-HA和PVA/n-HA支架

参照本课题组前期试验方法使用3D打印技术分别打印丝素蛋白/聚乙烯醇/纳米羟基磷灰石(SF/PVA/n-HA)支架与聚乙烯醇/纳米羟基磷灰石(PVA/n-HA)支架[4]。

1.3.2 羊骨髓间充质干细胞膜片的培养 4～6月龄阿勒泰大尾羊固定四肢后，肌内注射舒泰(10 mg/kg)和新速眠(0.1～0.2 mL/kg)麻醉。在髂骨平台区抽取羊骨髓(图1A)4～5 mL后转至超净工作台过滤后加入5～6 mL培养基，转入细胞瓶培养(图1B)。待二代细胞量达到80%～90%时将细胞接种至60 mm2的细胞培养皿中。等皿底细胞量达到100%后，采用连续诱导法构建骨髓间充质干细胞(bore marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)膜片(图1C)。

A：抽取羊BMSCs；B：羊BMSCs培养；C：羊 BMSCs膜片图1 羊BMSCs膜片的培养Fig.1 Cultivation of sheep BMSCs patch

1.3.3 支架植入 用膜片分别包裹SF/PVA/n-HA支架和PVA/n-HA支架备用，然后选12月龄阿勒泰大尾羊制备下颌骨缺损模型。分别植入对应支架，实验组为SF/PVA/n-HA支架复合细胞膜片，对照组为PVA/n-HA支架复合细胞膜片，空白组为明胶海绵复合细胞膜片(膜片组)。术前3%戊巴比妥钠0.005～0.020 mg/kg，静脉推注麻醉，口内外常规消毒。用牙科慢速手机制备骨缺损，同时生理盐水间断冲洗降温。骨缺损大小为20 mm×5 mm×3 mm(图2)[5-6]。最后植入细胞膜片包裹的支架，严密缝合。术后连续3 d肌内注射庆大霉素防止继发感染。

A：制备骨缺损；B：植入细胞膜片复合SF/PVA/n-HA支架；C：植入细胞膜片复合PVA/n-HA支架图2 下颌骨植入支架Fig.2 Stents implanted in mandible

分别于术后1、2、3个月处死相应的实验羊，取羊下颌骨，在冰上去除下颌骨实验部位周围软组织，最后将处理好的标本标记清楚后转入-80 ℃冰箱冷冻保存。

1.4 支架植入后指标检测

大体观察：在处死实验动物之前定期观察羊的进食情况，早期创口处缝线是否脱落，支架在植入后是否脱落，创口处及植入部位骨组织愈合情况。

锥形束CT检测：取样本进行锥形束CT检测，检测条件为将保鲜膜包裹的样本置于扫描台上进行三维扫描，然后选取颊舌向最宽处进行分析。观测3D打印组织工程骨在体内骨密度变化情况，比较体内降解支架回植前后降解情况。

HE染色分析：造模成功后术后1、2、3个月每月取对应4只实验羊处死，分别取边缘区、中央区的标本，先用40 g/L多聚甲醛固定液冲洗，然后将标本置于10%甲醛固定液中固定24 h。用15% EDTA脱钙液脱钙，待用大头针能轻松刺进骨组织时说明脱钙程度达标，然后将标本包埋切片，做HE染色。

Trizol法提取羊骨总RNA，用紫外分光光度计检测总的RNA浓度和纯度，若其浓度和纯度均达标才能逆转录RNA为cDNA，最后用PCR试剂盒SYBR Green PCR Kit(500)检测相关指标：IL-1、M-CSF、IL-6、NFATc1的表达量。引物由上海生工公司设计，具体引物序列见表1。相同基因重复测量3次取平均值。

表1 RT-PCR引物序列Tab.1 Primer sequence for RT-PCR

1.5 统计学方法

2 结 果

2.1 大体观察

植入手术结束后，所有实验羊均存活。术后3 d，实验羊因切口位于口内，进食困难，尽量流食喂养，4 d后进食恢复正常，切口愈合良好，口内缝线部分脱落。术后1、2、3个月分别处死后，取出下颌骨可见支架植入部位肌肉黏膜覆盖完全，无明显瘢痕。剥离植入部位表面肌肉以及黏膜后，可见SF/PVA/n-HA支架复合膜片组植入部位在术后1～2个月软组织逐渐长入支架，3个月时支架已完全被骨膜包裹，肉眼无法分辨，触摸质地较硬。而PVA/n-HA支架复合膜片组植入部位在术后1～2个月软组织部分长入，但长入程度明显低于SF/PVA/n-HA支架。3个月时PVA/n-HA支架植入部位还可看见部分支架，触摸时质地略软，可见支架与周围骨边界明显的分界线(图3)。

2.2 组织学观察

术后1个月，SF/PVA/n-HA支架复合膜片组与PVA/n-HA支架复合细胞膜片组可见疏松网状结缔组织包裹支架，散在分布成纤维细胞及炎症细胞，支架材料开始降解，SF/PVA/n-HA支架复合膜片组支架材料降解更明显；而膜片组可见大量疏松网状结缔组织，少量炎症细胞，新生血管几乎没有。术后2个月，支架进一步降解，降解支架周围可见纤维结缔组织包绕，SF/PVA/n-HA支架复合膜片组及PVA/n-HA支架复合膜片组均可见炎症细胞及纤维结缔组织；膜片组与术后1个月相比无明显变化，可见大量纤维结缔组织，炎症细胞少见。术后3个月，SF/PVA/n-HA支架复合膜片组支架材料几乎完全降解，被新的纤维组织、骨组织取代，也可发现少许巨噬细胞，炎症细胞较其他两组最少；PVA/n-HA支架复合膜片组仍可见支架残留物，膜片组可见少量新生血管，炎症细胞减少(图4)。

A：SF/PVA/n-HA支架复合膜片组术后3个月局部组织大体观察；B:PVA/n-HA支架复合膜片组术后2个月局部组织大体观察；箭头指示植入支架位置图3 大体观察Fig.3 General observation

2.3 降解相关因子mRNA表达水平检测

同一时间不同材料比较，SF/PVA/n-HA支架复合膜片组、PVA/n-HA支架复合膜片组分别与膜片组相比较P<0.05，差异具有统计学意义，SF/PVA/n-HA支架复合膜片组与PVA/n-HA支架复合膜片组相比，IL-1、IL-6、MCS-F、NFATc1四种因子表达趋势相近(图5)。在术后1、2个月，SF/PVA/n-HA支架复合膜片组四种因子的mRNA表达量均高于PVA/n-HA支架复合膜片组；术后3个月时，四种因子mRNA表达量SF/PVA/n-HA支架复合膜片组均低于PVA/n-HA支架组(P<0.05)。

黑色箭头指向剩余支架材料区，绿色箭头指向炎症细胞区，蓝色箭头指向骨陷窝区域，白色箭头指向巨噬细胞图4 植入不同时间点HE染色观察( ×10)Fig.4 Observation of HE staining after implanting at different time( ×10)

3 讨 论

骨组织工程中支架结合细胞、生长因子植入骨缺损处，为大面积的骨缺损提供了可行的思路。近几年人们将研究方向集中在支架的降解性能上，然而支架植入后其降解性能受支架自身的理化性能、植入部位的体内环境等影响较为复杂，具备降解性又能与体内环境相适应的支架是骨组织工程骨的必备条件。因此，通过动物实验来评价支架降解率受到广泛关注。

骨髓间充质干细胞可以提高材料的生物活性，并为骨形成提供合适的微环境[7]。支架上种子细胞密度是提高支架移植治疗效果的重要因素之一，而与单细胞移植相比，移植层状细胞膜片(cell sheet)可以促进相应功能的恢复和骨组织再生。细胞膜片技术(cell sheet technology， CST)也称细胞片层技术，是种子细胞利用自身的细胞外基质(ECM)形成的数层致密细胞聚合体，也是目前骨组织工程的常用方法之一[8]。因此本实验前期选用4～6月龄阿勒泰大尾羊培养羊BMSC膜片，以确保骨髓间充质干细胞的活性。用其包裹支架后再将支架植入12月龄阿勒泰大尾羊下颌骨内，12月龄的阿勒泰大尾羊已经达到成年状态，生长发育稳定，支架植入后骨改建相对平稳。

**：P<0.05图5 术后不同时期各组相关细胞因子表达的比较Fig.5 Comparison of the expression of related cytokine in each group during different periods after surgery

丝素蛋白的降解与流变学和力学性能有关[9]。将SF/PVA/n-HA支架植入阿勒泰大尾羊下颌骨后，羊在咀嚼食物时支架受力，力通过黏膜传递到支架，从而加速支架降解；植入部位位于下颌骨内，该部位血运丰富，有利于支架降解。

支架植入后会激活机体免疫系统，在后续的止血、组织愈合过程里，固有免疫系统和适应性免疫系统相继发挥作用[10]。因此，支架材料良好的生物相容性能避免不良的炎症反应，便于支架成功植入。组织学观察中，两种支架均能引起组织异物反应，但SF/PVA/n-HA支架植入区术后1、2、3个月HE染色观察发现炎症逐渐减轻，表明SF/PVA/n-HA支架植入后异物反应随着支架的降解，炎症反应随之减轻。同时SF/PVA/n-HA支架周围新生血管较PVA/n-HA支架多，表明丝素蛋白可促进血管形成，这与Zhang等[11]研究相符。支架材料降解时，细胞作用不可忽视，巨噬细胞是其中重要的一员，它的吞噬作用和其释放的细胞因子可以加速材料降解的速率[12]。SF/PVA/n-HA支架组织学观察中发现支架降解过程中，有巨噬细胞的出现，我们可以大胆猜测巨噬细胞的出现与SF/PVA/n-HA支架的降解有密不可分的关系。

不同支架植入体内后，机体的固有免疫系统、适应性免疫系统相继发挥作用[13-14]。中性粒细胞在此过程中清除死亡细胞并且分泌趋化因子招募巨噬细胞。有研究者发现丝素在降解过程与巨噬细胞密切相关[15]。在此过程中，巨噬细胞也会分泌IL-1、IL-6等促炎细胞因子，招募其他炎症细胞和免疫细胞。除此之外，IL-6也可促进骨吸收，对破骨细胞的形成也有一定的促进作用[16]。而巨噬细胞产生的TNF-α和IL-6细胞因子除了抑制成骨细胞合成碱性磷酸酶，还能抑制细胞外骨基质的分泌和矿化[17]。因此在此次实验中，我们选择IL-1、IL-6这两种因子作为支架植入之后评价支架降解的指标。从RT-PCR结果可以看出，在支架植入术后1、2、3个月内，SF/PVA/n-HA支架复合膜片组(有丝素支架组)IL-1、IL-6的相对表达量均高于PVA/n-HA支架复合膜片组(无丝素支架组)(P<0.05)，说明在前两个月，有丝素支架在植入后，巨噬细胞发挥作用，促进支架降解，与此同时，分泌IL-1、IL-6细胞因子，因此IL-1、IL-6的相对表达量高于无丝素组，在术后3个月时，有丝素支架组支架的降解接近尾声，巨噬细胞量减少，IL-1、IL-6相对表达量低于无丝素支架组(P<0.05)。而且有研究发现，在降解过程中产生SF颗粒在先天和适应性免疫系统的影响具有一定的抗肿瘤活性[18]，这可能是3个月末IL-1和IL-6表达降低的另一个可能原因。

骨再生与骨吸收是相互平衡的，支架一方面需要为成骨细胞的发育创造最佳条件，另一方面也需要确保破骨细胞能够发挥其主要作用，为骨形成提供相应的空间。因此，研究破骨细胞相关因子在新型生物材料上的分泌情况和功能具有重要意义。巨噬细胞、成纤维细胞、成骨细胞均可产生M-CSF[19-20]。有研究发现M-CSF是促进破骨细胞进一步成熟化的关键因子[21]。NFATc1在骨吸收过程中调节与破骨细胞相关的基因表达。破骨细胞形成早期，RANKL与破骨细胞前体细胞上的RANK结合，将细胞内肿瘤坏死因子受体相关因子6 (tumor necrosis factor receptor-associated factor 6，TRAF6)招募到RANK的细胞质结构域，从而刺激多种下游信号通路，包括核因子κB受体活化因子(receptor activator of nuclear factor-κB,NF-κB)、丝裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)和核活化T细胞因子(NFAT)通路[22]。NFATc1与破骨细胞的分化增殖密切相关[23]。在PCR结果中我们发现前两个月，有丝素支架组其M-CSF、NFATc1的mRNA相对表达量均高于无丝素支架组(P<0.05)，说明有丝素支架组的破骨细胞活动活跃，这与组织学观察结果一致。在术后3个月，有丝素支架组M-CSF、NFATc1的mRNA相对表达量明显降低，且低于无丝素支架组(P<0.05)，说明此时破骨细胞活跃度降低，骨吸收减弱，骨改建已经趋近尾声。而无丝素支架组M-CSF、NFATc1的mRNA相对表达量高于有丝素组，说明骨吸收在术后3个月还在继续。

4 结 论

具有良好的孔隙率和力学性能的SF/PVA/n-HA支架，植入体内后生物相容性好，引起的炎症反应较少，且在体内环境的作用下支架逐渐降解，在支架降解过程中新骨形成。因此SF/PVA/n-HA支架可作为骨组织工程中的一种新型支架材料。在体内实验过程中，支架受到炎症反应和骨改建过程的双重调控，发现SF/PVA/n-HA支架降解过程中M-CSF、IL-6等因子的相对表达量发生了变化。参加免疫反应的因子也参加了骨改建过程，这些因子之间的关系以及它们之间是否相互影响还需进一步研究。