温度和光照对平菇酪氨酸酶活力的影响及与子实体颜色的关系*

上官端琳，龚凤萍，段庆虎，竹 玮，易宏岩，冉忠萍，张应香

（信阳市农业科学院，河南 信阳 464000）

平菇 （Pleurotus ostreatus），侧耳科 （Pleurotaceae） 侧耳属（Pleurotus） 真菌，是消费青睐的大宗食用菌之一，其子实体颜色是消费者选择的重要标准之一，有的消费者喜欢白色品种，有的喜欢黑色品种。因此，子实体颜色常常是育种者考虑的主要因素之一。在平菇栽培管理过程中发现，平菇子实体颜色因温度和光照强度的不同而深浅不一，说明温度和光照强度对平菇子实体颜色深浅有一定影响。查阅食用菌栽培相关文献得知，光照强度对食用菌菌丝生长、出菇、产量、子实体形态特征及色泽等方面均有影响[1]。张桂香等[2]在研究中发现香菇在过强的光照下无法正常转色或转色期延长，金针菇会随着光照强度增加，菇体色泽逐渐加深，菌盖变大，褐斑增多，菌柄变粗变短，商品价值变低。何莉莉等[3]在研究温度和光照对鲍鱼菇生长发育影响中发现，鲍鱼菇在100 lx散射光下原基分化较好，速度快，形态粗壮，数量多。吴惧等[4]在研究光对灵芝生长发育影响时发现，不同生长发育期对光的要求不同，光线对菌丝生长有抑制作用，子实体发育的最适光强与产孢期不同。韩建荣[5]在对木耳子实体生长阶段酪氨酸酶活性与温度光照和子实体颜色关系的研究中发现，木耳子实体颜色的变化原因之一是由于温度和光照强度对酪氨酸酶活力的影响，造成子实体中黑色素的含量不同，而子实体中黑色素含量高则颜色深。罗茂春等[6]在光质对红平菇菌丝体和子实体生长发育影响的研究中也表明，光照时间和光照强度对红平菇子实体颜色和产量有影响。对于平菇子实体颜色，有研究表明，平菇子实体颜色是数量性状[7]，受环境因素影响较大；平菇子实体颜色主要与黑色素的代谢有关，酪氨酸酶是影响黑色素代谢的主要酶类之一[8]。

鉴于上述情况，结合相关文献论述，猜测平菇子实体颜色的深浅是由于栽培环境条件改变酪氨酸酶的活力，从而影响子实体中黑色素合成的量。该试验通过研究温度和光照强度对平菇子实体颜色深浅的影响，以期找到平菇子实体颜色深浅与温度、光照强度之间的关系，为平菇定向育种及工厂化生产优质平菇建立科学的理论依据及数据支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试菌株：平99，由信阳市农业科学院保藏。

母种培养基：马铃薯 200 g·L-1、葡萄糖 20 g·L-1、琼脂粉2%。121℃高压蒸气灭菌30 min备用。

原种培养基：麦粒98%、石膏2%。

栽培种培养基：棉籽壳98%、石灰2%，料水比1∶1.2。料水拌匀后装袋，121℃高压蒸气灭菌2 h备用。

栽培培养基：棉籽壳98%、石灰2%，料水比1∶1.2。料水拌匀后起堆发酵，堆高0.8 m，宽2 m，长度不限。堆好后，在堆上每间距30 cm处打密集透气孔，当堆温达65℃时翻堆1次，如此翻堆2次后晾凉、装袋，常压蒸汽蒸料，待料温达到93℃时停火焖4 h～5 h备用。

1.2 试验方法

1.2.1 温度对平菇酪氨酸酶活力的影响及与子实体颜色的关系

将满袋的平菇菌袋转入环境条件适宜，温度分别为15℃、18℃、25℃、自然温度的出菇房中进行出菇管理，记录平菇菇蕾期、成熟期、老化期的子实体颜色并取基质测定酪氨酸酶活力。

1.2.2 光照强度对平菇酪氨酸酶活力的影响及与子实体颜色的关系

将满袋的平菇菌袋转入环境条件适宜，光照强度分别为100 lx、500 lx、1 000 lx、1 500 lx、2 500 lx的出菇房中进行出菇管理，记录平菇菇蕾期、成熟期、老化期的子实体颜色并取基质测酪氨酸酶活力。

1.2.3 温度和光照强度正交试验

根据单因素试验结果，选取3个温度、3个光照强度为正交试验水平进行正交试验，记录平菇菇蕾期、成熟期、老化期的子实体颜色并取基质测成熟期酪氨酸酶活力。

1.2.4 酪氨酸酶活力的测定

取待测样品5.0 g，加入pH 7.2的Na2HPO4-HCl缓冲溶液 20 mL，4℃、200 r·min-1提取 4 h，4℃、8 000 r·min-1离心10 min，取上清液，即为粗酶液。在试管中加入浓度为0.01 mol·L-1多巴溶液0.5 mL及pH 6.0磷酸缓冲液2.5 mL，30℃水浴10 min，加1 mL粗酶液摇匀，立即于分光光度计480 nm处测定吸光度值A，以吸光度值增加0.001为1个酶活单位，不加多巴溶液（以磷酸缓冲液替代） 为对照，计算原料中酪氨酸酶活力。粗酶液酶活力（U1，U·mL-1）计算公式为：

式中：A为样品吸光度值；A对照为对照吸光度值；t为反应时间（min）；V1为粗酶液体积（mL）。

原料中酪氨酸酶活力（U2，U·g-1）计算公式为：

式中：V为粗酶液总体积（mL）；m为样品质量（g）。

1.2.5 数据处理

分别采用Excel和Origin 8软件进行数据处理。

2 结果与分析

2.1 温度对平菇酪氨酸酶活力的影响及与子实体颜色的关系

在不同温度下，平菇“平99”的菇蕾期、成熟期、老化期子实体菌盖颜色见表1，酪氨酸酶活力见图1。

表1 温度对子实体颜色的影响Tab.1 Effects of temperature on fruit body color

图1 栽培环境温度对酪氨酸酶活力的影响Fig.1 Effects of cultivation environment temperature on tyrosinase activity

由表1可以看出，在同一温度的不同生长时期，平菇菇蕾期的子实体颜色最深，随着子实体成熟，颜色逐渐变浅；平菇在成熟期的不同温度条件下，子实体颜色基本随温度的升高而变浅，在15℃时子实体颜色最深，25℃时最浅。由图1可以看出，在同一温度的不同生长时期，酪氨酸酶活力基本在菇蕾期最高，随着子实体成熟其酶活力降低；在同一生长期的不同温度条件下，温度<25℃时酪氨酸酶活力较强，酪氨酸酶催化酪氨酸转化的黑色素较多，则子实体菌盖颜色较深。因平菇产品在成熟期采摘，所以以成熟期的子实体颜色和酪氨酸酶活力为主要指标，选取15℃、18℃及自然温度为正交试验温度水平。

2.2 光照强度对平菇酪氨酸酶活力的影响及与子实体颜色的关系

在不同光照强度条件下，平菇菇蕾期、成熟期、老化期子实体颜色见表2，酪氨酸酶活力见图2。

表2 光照强度对子实体颜色的影响Tab.2 Effects of light intensity on fruit body color

图2 栽培环境光照强度对酪氨酸酶活力的影响Fig.2 Effects of cultivation light intensity on tyrosinase activity

由表2可以看出，在同一光照强度的不同生长时期，平菇菇蕾期的子实体颜色最深，随着子实体成熟，其颜色逐渐变浅；平菇在同一生长期的不同光照强度条件下，子实体颜色随光照强度的增强呈先深后浅趋势，在500 lx～1 500 lx时子实体颜色较深，其次是100 lx〜500 lx，光照强度>1 500 lx时菌盖颜色较浅。由图2可以看出，在同一光照强度的不同生长时期，500 lx～2 500 lx时酪氨酸酶活力在菇蕾期最高，随着子实体成熟其酶活力降低；在同一生长期光照强度≦1 500 lx时酪氨酸酶活力较强，催化酪氨酸转化的黑色素较多，故子实体颜色较深。因平菇产品在成熟期采摘，所以以成熟期的子实体颜色和酪氨酸酶活力为主要指标，选取光照强度500 lx、1 000 lx、1 500 lx为正交试验水平。

2.3 温度和光照强度正交试验

根据单因素试验结果，选取温度水平为15℃、18℃、自然温度，光照强度水平为500 lx、1 000 lx、1 500 lx，正交试验因素水平见表3。根据表3安排试验组合，正交试验分析见表4，平菇不同时期子实体颜色见表5。

表3 正交试验因素水平Tab.3 Orthogonal experimental factors

表4 正交试验设计及结果Tab.4 Orthogonal experimental design and results

表5 不同时期子实体颜色Tab.5 Fruit body color of different periods

如表4所示，根据极差值的大小，各因素影响酪氨酸酶活力的主次顺序为：温度>光照强度；并得到每个因素的最好水平，即A1B2。因此，可以使酪氨酸酶活力最强的最佳栽培条件为：温度15℃，光照强度1 000 lx。从表5可以看出，处理1（15℃，1 000 lx）的各个生长时期子实体颜色均较深，因子实体颜色是通过感官评价，颜色描述存在一定的误差，所以以酶活为主要指标。综合考虑选择15℃、1 000 lx为最佳栽培条件。

3 结论与讨论

试验初步探索了平菇子实体颜色与温度、光照强度之间的关系，结果表明，平菇可通过左旋多巴（levodopa，L-dopa） 途径合成黑色素；温度和光照强度通过影响与子实体颜色相关的酶（酪氨酸酶）的活力而影响子实体颜色；平菇酪氨酸酶活力在平菇子实体生长过程中逐渐降低，菇蕾期的酶活力最高，催化合成的黑色素最多，子实体颜色最深，该结论同张妍等[9]在佛罗里达侧耳遗传连锁图谱构建及菌盖颜色性状的QTL定位研究的结论（5个候选基因的表达量在菌丝期、幼菇期、成熟期、衰老期四个不同发育阶段呈现一致的变化趋势，且在菌盖颜色最深的幼菇期表达量最高） 一致；栽培温度为15℃、光照强度为1 000 lx时，平菇“平99”子实体颜色最深。

因食用菌黑色素合成途径主要有L-dopa途径（关键的酶为酪氨酸酶、漆酶）和DHN途径（关键的酶为聚酮合成酶）2种途径[8]。本试验只初步探索了L-dopa途径中的酪氨酸酶活力,平菇黑色素的主要合成途径和黑色素合成过程中起决定性作用的酶尚不可知，本项目研究结果只能说明平菇的黑色素合成途径有L-dopa途径，酪氨酸酶是平菇合成黑色素的酶之一，且酪氨酸酶的活力受温度和光照强度的影响，温度是最主要因素。

下一步可以通过分子水平找到黑色素合成酶的相关基因，探索相关酶类基因表达水平与子实体颜色深浅的关系，以期在菌丝期初筛出期望的品种（黑色、灰色或白色），再通过控制环境条件（温度和光照强度）进行出菇试验，为平菇定向育种及工厂化生产优质菇提供参考及数据支撑。