正常精浆替换精浆液化不良患者异常精浆对精子前向运动影响研究

刘 敏

（赣南医学院第一附属医院生殖医学科，江西 赣州 341000）

人类精液在射精后立即凝结，通常在体外大约15～20 min 内液化［1］。精液不液化是指射精后1 h 内精液未液化［2］的现象，目前报道其发生率并不少见。精液不液化常合并精子运动力下降，是造成男性不育症常见病因［3］。关于精子运动力下降原因，目前国内外无相关研究专门研究精液不液化患者精子运动力下降原因。有研究认为是异常精浆免疫成分造成的［4］；也有研究认为不液化的精液中纤维交织成网，物理作用限制了精子运动［5］。本文通过比较液化不良患者异常精浆和液化正常者精浆置换后两组精子前向运动百分率变化，研究液化不良患者精子活动力下降原因，旨在为精液不液化相关疾病导致男性不育的治疗提供指导。

1 资料与方法

1.1 一般资料 本研究经过医学伦理委员会审核通过，每位受试者均签署知情同意书并告知实验目的、步骤等情况。选取2017 年5 月—2020 年4 月本院精液不液化合并弱精症患者28例为液化不良组，另外选取28 例有生育且精液常规检查结果正常为液化正常组。液化不良组年龄21～46 岁，平均（30.1±5.7）岁，所有患者体检男性性征、生殖器无畸形，睾丸大小无明显异常。液化正常组年龄20～39岁，平均（29.8±3.7）岁，男性体格检查正常。

1.2 纳入和排除标准 纳入标准：液化不良组纳入标准根据WHO 规定，新鲜离体标本应该在室温60 min 内发生液化，如果超过60 min 仍然含有不液化的凝块或者黏液丝，则称为精液不液化。液化正常组纳入标准：体检健康，离体精液标本都在室温30 min内发生液化。排除标准：重度少精子症；睾丸体积（双侧）＜8 mL、外周血常规染色体检查无异常和Y染色体微缺失检查正常等明确弱精症病因的。

1.3 方法

1.3.1 标本收集和精子质量分析 两组患者均按生殖医学科标准流程操作，禁欲2～7 d，取精室手淫取精。收集完整精液于无菌取精杯中，即送男科实验室，置于37 ℃恒温水浴箱中，每10 min观察1次，观察精液中是否存在不液化凝块或黏液丝，记录凝块或黏液丝消失的时间。严格按照《WHO人类精液检查与处理实验室手册（第五版）》标准，采用计算机辅助的精子自动分析系统（CASA），分别记录两组精液标本实验前后的液化情况，浓度、前向运动精子百分率（percentage of forward motile sperm，PR）等指标。

1.3.2 分离得到单纯精浆和精子 两组精液标本采用短时高速离心方法得到单纯精浆成分，3 000 g离心，5 min 后取上层精浆1～3 mL，镜检确认精浆中无精子存在，得到了不含精子的精浆成分［6］。短时高速离心是蛋白质芯片-飞行时间质谱技术对精浆处理常用手段，主要用于检查异常精浆蛋白质，短时高速离心已经证实对精浆内蛋白质含量无明显影响。密度梯度离心法处理精液前后精子活力差异无统计学意义［7］，所以采用密度梯度离心法处理精液。采用密度梯度离心得到富集精子，有明显凝块的精液标本可用注射器多次吹打精液促进液化。液化后的精液放置于下层95%、上层75%的密度梯度离心液（Isolate，Irvine 公司）中以300 g，18 min 梯度离心，然后取下层离心液于3 mL G-ivf（VItrolife公司）中以200 g转速再次离心。舍去上层多余的G-ivf，留取0.5 mL 液体。这样得到两组分离的单纯精浆和富集精子成分。

1.3.3 精浆交换和计算机辅助精子分析（CASA）

液化不良组富集精子成分0.5 mL 和液化正常组单纯精浆0.5 mL 相互混合，轻摇混匀后放置37 ℃恒温水浴箱中，30 min 后记录前向运动精子百分率（PR）值。同样方法处理液化正常组精子成分0.5 mL和液化不良组单纯精浆，两者混匀并记录PR值。

1.4 统计学方法 采用SPSS 13.0软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用两独立样本t检验，组内比较采用配对样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

置换前液化正常组的精子PR 明显大于液化不良组，差异有统计学意义（P＜0.05）；置换后两组间PR 值差异无统计学意义（P＞0.05）。从两组内的PR 纵向比较显示，置换前后两组精子PR 明显呈升降变化，液化正常组精子PR 下降而液化不良组上升，PR 变化差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 精浆置换前后不同组间PR和组内PR变化比较/±s

注：PR：精子前向运动精子百分率。

组别液化不良组液化正常组n t P 28 28 15.233 7.127 0.016 0.027 tP精浆替换前PR 21.57±3.63 45.26±9.64 12.170 0.021精浆替换后PR 40.83±5.62 30.89±4.57 1.901 0.073

3 讨 论

人类精液在射精离体后立即凝固，随后出现精液液化过程，这是人类进化过程中重要的生理现象。液化过程通常在15～20 min 内完成，其液化过程受凝块中精浆蛋白部分水解程度的影响［8］。有文献指出精液不液化影响了大约12%～29%的男性不育患者［9］。精液不液化不仅对精液的物理和生化特性有不利影响，而且还对精子的活力和形态等重要参数产生负面影响；但对精子存活率和精子数量、浓度无影响［10］。对于精子活力方面，有研究认为精液不液化表现出阻碍精子前向运动的捕获物理效应，将精子捕获在由精浆蛋白形成的基质中，从而影响精子运动并对生育能力产生负面影响［11］。也有研究利用荧光定位证实发现精囊凝固蛋白Ⅰ（Semenogelin Ⅰ，Sg Ⅰ）通过与精子表面的附睾蛋白酶抑制剂（Epididymis protease inhibitor，Eppin）相结合形成Sg Ⅰ-Eppin 复合体覆盖在于精子表面，从而抑制精子的前向运动［12］。有研究分析了616对夫妇的精液质量与性交后测试（the postcoital test，PCT）结果之间的关系，认为更好的精液液化时间与显著改善PCT 的结果正相关［13］。所以精液不液化患者异常精浆可能是导致男性不育的重要因素。为了研究精液不液化异常精浆对精子前向运动影响程度，本研究首次利用正常精浆和异常精浆交换后精子前向运动精子百分率（PR）变化的方法，目前国内外还未有精浆交换用于精子活力方面的研究。本研究观察的是精子前向运动，因此排除了小睾丸、外周血常染色体和Y染色体微缺失检查异常等明确弱精症病因的患者。

本研究结果显示：①精浆置换前液化正常组的精子PR 明显大于液化不良组。与GONZALES GF等［3］研究结果一致，提示精液不液化患者通常有弱精症表现。②精浆置换前后同组精子PR 有明显变化，液化不良组PR 升高，而液化正常组PR 下降，置换后两组间PR 值差异无统计学意义。上述实验数据说明精浆置换后液化不良组异常精浆降低了液化正常组正常精子前向运动百分率，而正常精浆对不液化不良组精子作用提高了PR。实验结果证实精液不液化患者精子活力下降是异常精浆导致，而非精子自身原因。

目前认为精液凝固和液化是精子前向运动和精子获能的关键，而精液液化过程受多因素影响。精浆内的精囊凝固蛋白（Sg Ⅰ）、附睾蛋白酶抑制剂（Eppin）与前列腺特异性抗原（Prostate specific antigen，PSA）在调控精液凝固与液化过程中起主导作用［14］。与正常男性组对比，精液不液化使得精液中Sg Ⅰ仍然停留在精子表面，进一步导致精子运动能力降低［15］。而正常精浆中含有如纤溶酶原、系统组织纤溶酶原激活剂（Tissue-typeplasminogenactivator，tPA）及尿激酶纤溶酶原激活剂（Urokinase-typeplasminogen activator，uPA）、前列腺释放的激肽释放酶等蛋白酶类等促进或诱导精液液化，可能是精浆置换后精子前向运动变化的原因。

因此本研究结果有助于为精液不液化提供治疗方向，治疗此疾病更应针对异常精浆，促进精液液化提高精子活力，而不是单纯利用提高精子活性类药物。