基于siRNA经皮给药系统用于皮肤疾病治疗的研究进展*

任会红，张瑜娟，闵卫平，

(南昌大学1.药学院；2.基础医学院免疫学教研室；3.免疫与生物治疗研究所；4.江西省免疫与生物治疗重点实验室，南昌 330006)

小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)是一类长度为20～25个核苷酸的RNA分子，通过RNA干扰(RNA interference，RNAi)的方式调节基因表达，使靶信使RNA进行特异性沉默，从而实现基因治疗的目的[1]。皮肤作为人体的最大器官，是siRNA最易到达的靶器官，临床试验报告以细胞毒性T淋巴细胞相关抗原 -4[2]和程序性细胞死亡-1[3]为靶点的siRNA抑制剂可用于皮肤黑色素瘤患者的临床治疗，为皮肤相关疾病的临床治疗提供了新的研究方向。

经皮给药系统(transdermal drug delivery systems，TDDs)是药物透过皮肤，经毛细血管吸收进入人体血液循环，产生局部或全身治疗作用，实现预防或治疗疾病的给药途径[4]。经皮给药作为新颖的给药方式，具有局部靶向性好，患者依从性高，给药可控可持续且无肝脏首关效应等优势，使得siRNA经皮给药系统成为皮肤疾病治疗研究的热点[5]。然而，由于siRNA具有强亲水性和电负性，易被核酸酶降解及难以突破皮肤角质层屏障作用等缺陷，限制了其应用。虽然皮内注射为siRNA的应用提供了有效的给药途径，然而由于剧烈的疼痛感、有限的给药点和给药次数，使其应用仍受到极大的限制[6]。

近年来，纳米粒(nanoparticles，NPs)由于具有合适的粒径、良好的生物相容性、可控的药物释放性以及较低的细胞毒性等优点，成为递送siRNA经皮给药的有效载体[7]。笔者对纳米载体携载siRNA在皮肤疾病治疗中的应用进行综述，以期为皮肤疾病治疗提供更安全、有效、实用的给药手段。

1 siRNA经皮给药的新型纳米载体

1.1脂质纳米粒(lipid nanoparticles，LNPs) LNPs由于其粘附于皮肤上形成单层疏水膜，进而引起闭合效应，可防止水分流失、角质细胞堆积减少和角质细胞间隙扩大，从而促进siRNA的吸收和皮肤渗透，现已被广泛用于基因药物、抗肿瘤药物、蛋白质和多肽等药物的经皮递送载体[8]。为增强LNPs携载 siRNA 的经皮递送，BOAKYE等[9]利用新型吡咯烷脂质制备阳离子脂质纳米粒载体，负载厄洛替尼和白细胞介素(IL)36α siRNA局部用于C57BL/6小鼠银屑病样斑块的治疗，能明显增加厄洛替尼的皮肤保留率和IL36α siRNA的皮肤渗透率。TRAN等[10]利用新型阳离子脂质纳米粒装载靶向V600EBRAF和Akt3基因的siRNA，将其局部用于裸鼠黑色素瘤模型中，结果显示siRNA可被有效递送到皮肤病变的黑色素瘤细胞中，降低V600EBRAF和Akt3基因的表达，进而为靶向抑制早期或侵袭性皮肤黑色素瘤提供了有效途径。

1.2介孔二氧化硅纳米粒(mesoporous silica nano-particles，MSNs) MSNs不仅具有较大的比表面积、较高的孔隙率及可调的孔径结构等特点，还可以通过表面修饰或包覆功能性物质，实现对肿瘤细胞的靶向性，并且其稳定的框架结构可以保护和递送核酸分子，以达到基因治疗的目的。因此，被认为是递送核酸分子、蛋白质、化疗药物的优良载体[11]。MORRY等[12]用聚乙烯亚胺和聚乙二醇对MSNs进行表面修饰后，作为靶向热休克蛋白47(heat shock proteins 47，HSP47) siRNA的递送载体；其带正电荷的聚乙烯亚胺中和了siRNA的负电荷，增强了siRNA的稳定性，聚乙二醇层保护siRNA免被核酸酶降解；体外纤维化模型研究中，MSNs有效地递送了靶向HSP47的siRNA；通过小鼠硬皮病模型进行体内评价，显示给予HSP47 siRNA纳米粒治疗后能有效地将HSP47在皮肤中的表达降低到正常水平，进而增强皮肤抗纤维化作用。LIN等[13]利用细胞可裂解的阳离子聚合物表面功能化的MSNs作为递送siRNA的载体，并进行了体内外评价，结果显示功能化的MSNs具有较高的正电荷，对siRNA具有良好的结合能力，并增强了siRNA的细胞摄取率。

1.3聚合物纳米粒(polymeric nanoparticles，PNs) PNs可与带负电荷的siRNA通过静电结合而自发形成siRNA-聚合物复合物，极大降低了siRNA表面的负电荷，提高了其稳定性；同时聚合物本身对siRNA的保护和屏障作用，减少了siRNA的降解和细胞毒性，因此成为一种被广泛用于siRNA递送的新型药物载体[14-15]。CUN等[16]通过双重乳液溶剂蒸发法制备载有siRNA的乳酸-乙醇酸聚合物纳米粒，不仅具有良好生物相容性和可降解性，而且极大增加了siRNA在乳酸-乙醇酸纳米粒子中的负载率和包封率。DESAI等[17]合成了一种具有环状吡咯烷头部基团和聚乳酸-乙醇酸阳离子两亲性基团的新型可生物降解的脂质聚合物纳米载体(CyLiPn)，携载肿瘤坏死因子α(TNF-α)siRNA用于治疗慢性皮肤炎症疾病；小鼠体内的生物分布研究显示CyLiPn可有效地将TNF-α siRNA递送到深层真皮环境中；由咪喹莫特诱导的银屑病斑块样模型治疗结果显示，携带TNF-α siRNA的CyLiPn能够显著降低TNF-α、核因子(NF)-κB、IL-17、IL-23和Ki-67基因的表达。

1.4金纳米粒(Au nanoparticles，AuNPs) AuNPs由于具有独特的光学特性、良好的生物惰性、局部表面等离子共振效应以及高效的光热转换能力等特点，已被用于多种药物及核酸分子的递送载体[18]。有研究[19]表明将AuNPs良好的等离子体特性与RNAi途径相结合，通过对AuNPs进行功能化修饰后，在近红外激光照射下，可使siRNA在特定部位通过热等离子体机制以可控方式释放。由于AuNPs本身具有相对惰性及近红外激光在生物组织中具有较大的穿透能力，被认为是递送siRNA的理想载体。ZHANG等[20]开发了一种新型功能化金纳米载体FA-AuNRs，用于介导siRNA靶向沉默肿瘤BRAF突变基因，再联合光热效应用于治疗黑色素瘤；体内外实验表明， FA-AuNRs对BRAF siRNA具有较高的装载率，并且提高其在血清中的稳定性，增强了对皮肤的渗透性，对C57BL/6小鼠黑色素瘤样模型进行治疗后， 显著抑制了BRAF基因的表达和黑色素瘤的生长。

2 纳米载体联合其他途径协同增强siRNA的经皮给药

2.1联合细胞穿透肽(cell penetrating peptides，CPPs) CPPs具有显著的跨膜转导能力，可有效转运如siRNA、核酸和蛋白质等多种生物活性分子穿透细胞膜进入细胞内，保证活性分子正常发挥作用且不产生毒性反应[21]。因此，纳米载体联合CPPs可提高纳米载体的细胞摄取和跨膜转导能力，增强siRNA在经皮给药中的递送效果。寡聚精氨酸(R8)和反式激活转录蛋白(transactivative transcription protein，TAT)多肽是一类高正电荷的阳离子型CPPs，可与负电荷的siRNA通过静电作用相互络合。RUAN等[22]开发了一种基于细胞穿透肽R8纳米复合物的BRAF siRNA给药系统，用于局部靶向治疗黑色素瘤；体内外实验表明，R8/BRAF siRNA纳米复合物能够显著增强BRAF siRNA的转染效率，降低BRAF基因的表达，诱导肿瘤细胞凋亡，抑制黑色素瘤的生长。PETRILLI等[23]以细胞穿透肽TAT功能化的新型液晶纳米分散体为载体，负载TNF-α siRNA局部用于化学诱导的炎症动物模型中；体内外研究表明，经TAT修饰后，提高了纳米粒的细胞转染效率和吸收效率，并且提高了siRNA的皮肤渗透率，显著抑制促炎细胞因子TNF-α的表达。

2.2联合离子导入(iontophoresis，IP) FUKUTA等[24]研究表明，亲水性大分子(如siRNA和纳米颗粒)在弱电流[0.3～0.5 mA·(cm2)-1]下通过IP经皮渗透到皮肤中，在皮肤组织内传递并随后发挥其功能。IP[0.4 mA·(cm2)-1]给药后，异硫氰酸荧光素标记的IgG抗体在皮肤内广泛可见，并从表皮层延伸至真皮层。在咪喹莫特诱导的银屑病模型大鼠中，抗体也通过IP传递到炎症的皮肤组织中。LABALA等[25-26]用壳聚糖包裹的AuNPs负载STAT3 siRNA，在IP作用下，以B16-F10小鼠黑色素瘤细胞为模型进行体外研究；结果表明IP增强了负载siRNA的AuNPs的皮肤渗透性，黑色素瘤细胞通过内吞机制迅速摄取负载STAT3 siRNA的AuNPs-CS纳米载体，抑制STAT3蛋白的过度表达；以黑色素瘤荷瘤小鼠为模型进行体内研究，使用0.5 mA·(cm2)-1弱电流通过IP局部给药后，显示肿瘤体积百分比和肿瘤质量显著减小，STAT3蛋白表达显著降低。

2.3联合微针 大量研究证实，微针介导纳米颗粒的经皮给药可显著增加皮肤对NPs的通透性。KUMAR等[27]评估了经微针预处理后，在体内外促进纳米粒皮肤渗透的效果及微生物感染的潜在风险；研究表明用微针对小鼠皮肤进行预处理，使粒径230 nm的固体脂质纳米粒在其表面与卵清蛋白结合，可实现皮肤渗透并诱导抗卵清蛋白抗体反应，且在允许纳米颗粒渗透的同时降低了细菌和病毒的渗透。WANG等[28]建立了一种包含透明质酸基质和MSNs包覆的纳米粒包埋微针体系，利用MSNs壳加载靶向转化生长因子β1型受体的siRNA并对其进行保护，微针体系被植入皮肤后，溶解并释放纳米粒，通过皮肤组织扩散后，被真皮层的成纤维细胞吸收内化，释放siRNA抑制结缔组织生长因子mRNA的表达，进而抑制成纤维细胞的过度增殖和胶原的过度生产，阻止瘢痕异常发育。

3 纳米载体携载siRNA在皮肤疾病中的应用前景

皮肤疾病的种类繁多，发病机制复杂，治疗效果和预后均不理想。一些皮肤炎症如银屑病或特应性皮炎的发生发展过程涉及多种促炎细胞因子和趋化因子的影响；致死率较高的皮肤癌如黑色素瘤或鳞状细胞癌的发病过程中，某些特定基因会高度表达或发生基因突变，进而引起病症恶化。而siRNA作为有效的生物标记物和治疗靶点，在皮肤局部给药后，可以直接调节皮肤中的靶细胞，发挥治疗作用。因此，siRNA经皮给药为皮肤疾病的临床研究提供了新的方向。

siRNA经皮给药的有效靶点包括：①BRAF是黑色素瘤中最常见的突变基因，该突变通过丝裂原激活蛋白激酶途径激活下游信号，这为黑色素瘤的治疗提供了一个有吸引力的靶点[29]。②林简等[30]研究表明在人皮肤鳞状细胞癌A431细胞中，siRNA干扰N-myc下游基因的表达，可以抑制磷酯酰肌醇3激酶/丝氨酸激酶信号通路转导，进而抑制癌细胞生长，促进癌细胞凋亡，为皮肤鳞状细胞癌治疗提供了新的靶点。③LIO等[31]研究表明抑制皮肤鳞状细胞癌异种移植小鼠肿瘤中TGFβR-1的表达，可降低肿瘤生长速度，因此TGFβR-1可作为RNAi治疗皮肤鳞状细胞癌的有效靶点。

但必须看到，携载siRNA经皮给药系统用于皮肤疾病治疗的研究中尚存在多个未解决的问题：一是需筛选最佳siRNA序列，进而保证其在靶向性沉默和疾病治疗方面具有最佳效果。二是siRNA经皮给药的纳米载体所涉及的长期安全性和可能产生的皮肤刺激及其他不良反应等问题，如在siRNA给药的研究中，大多数临床试验是基于脂质体纳米粒，而其他纳米粒载体MSNs、AuNPs或PNs仍存在生物相容性差和不可生物降解等问题。三是IP常伴有疼痛感，微针所导致的开放性伤口也容易引起皮肤病毒和细菌感染。所以，未来研究的重点仍是为不同类型的皮肤疾病患者提供有效且安全的siRNA经皮给药系统，以保证在有效给药和安全性之间达到适当的平衡。

4 结束语

RNAi作为一种新的基因敲除机制，可通过siRNA对皮肤疾病的特定靶基因进行特异性调节，从而实现基因治疗的目的。此机制不仅具有较高的特异性，而且显著降低了全身毒副作用，因此具有广泛的临床应用价值和潜力。而TDDS不仅在动物实验中显示改善了siRNA的生物利用度，而且可提高患者的依从性，为基于siRNA的皮肤疾病治疗提供了一种安全的给药系统。随着对siRNA经皮给药纳米载体的不断深入研究，与纳米载体介导的RNAi技术的逐渐完善和成熟，将会为皮肤疾病的治疗提供更安全、更有效、更实用的载药手段。