三叶青黄酮调节PI3K/Akt-eNOS信号通路对膀胱癌细胞生物学行为的影响及其机制

吴琦

[關键词] 三叶青黄酮;PI3K/Akt-eNOS信号通路;膀胱癌;细胞生物学行为

[中图分类号] R285.5          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2021）18-0031-04

Effects of cloverleaf flavonoids on biological behavior of bladder cancer cells by regulating PI3K/Akt-eNOS signaling pathway and its mechanism

WU Qi

Department of Urinary Surgery， Lishui People′s Hospital of Zhejiang Province， Lishui   323000， China

[Abstract] Objective To analyze the effects of cloverleaf flavonoids on the biological behavior of bladder cancer cells by regulating PI3K/Akt-eNOS signaling pathway and its mechanism. Methods The T24 cells in logarithmic growth phase were divided into the blank control group， the high concentration group and the low concentration group. The blank control group was cultured in the blank medium during treatment， and the cells in the high concentration group and the low concentration group were treated with 100 μg/mL and 50 μg/mL of cloverleaf flavonoids. The proliferation， apoptosis， migration and invasion activities of cells were detected， and the protein expression levels of PI3K， Akt， p-Akt， eNOS and β-actin were detected. Results Significant differences in the proliferation， apoptosis， migration and invasion activities of T24 cells were observed in the blank group， the low concentration group and the high concentration group， among which the proliferation， migration and invasion activities of T24 cells in the high concentration group were the lowest， and the apoptosis activity in the high concentration group was the highest， with statistical significance in pair comparisons between groups （P<0.05）. Hoechest staining results showed that the cell nuclei in the blank control group were relatively complete and uniform in color. Cell nuclei in the low concentration group and the high concentration group collapsed， lysed fragments and apoptotic bodies were visible， and the apoptosis of cells was increased with the increase of the drug concentration. Significant differences in the levels of PI3K， p-Akt and eNOS in T24 cells were observed of the blank control group， the low concentration group and the high concentration group， among which the levels of PI3K， p-Akt and eNOS in the high concentration group were the lowest， with statistical significance in pair comparisons between groups （P<0.05）. Conclusion Cloverleaf flavonoids can inhibit the proliferation， migration and invasion of bladder cancer cells by regulating PI3K/Akt-eNOS signaling pathway， and promote cell apoptosis.

[Key words] Cloverleaf flavonoids; PI3K/Akt-eNOS signaling pathway; Bladder cancer; Cell biological behavior

膀胱癌是现阶段临床中较为常见的泌尿生殖道恶性肿瘤，对人类健康造成严重威胁[1-2]。膀胱癌具有极强的迁移和侵袭能力，虽然采用手术治疗可将患者的病灶切除，但膀胱癌患者术后极易复发，导致患者的术后五年生存率较低[3-4]。三叶青是目前最为常见的中草药之一，具有较强的保肝和抗肿瘤效果，黄酮类成分是其主要的药理成分[5-6]。三叶青黄酮对人胃癌细胞SGC7901和乳腺癌细胞MCF-7细胞干预后，可显著促进并诱导细胞凋亡，抑制细胞迁移和增殖[7]。动物水平研究结果显示，使用三叶青黄酮对H22肝癌荷瘤小鼠治疗后可有效抑制肿瘤增殖，降低肿瘤体积，延长小鼠生存期[8]。因而本研究分析三叶青黄酮对膀胱癌细胞生物学行为的影响及其作用机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料

三叶青黄酮购买自成都曼斯特，RPMI 1640完全培养基、胎牛血清、胰蛋白酶（含EDTA）购买自美国Gibco公司，Propidium Iodide、Annexin V-FITC、Hoechst 33258 荧光染料、PI3K抗体、Akt抗体、p-Akt抗体、eNOS抗体、β-actin抗体、二抗抗体购买自美国CST公司，四甲基偶氮唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）购买自上海生工科技，Transwell上室购买自康宁公司，ECL显影液购买自美国密理博公司。

1.2 细胞培养

人膀胱癌T24细胞使用RPMI 1640完全培养基（含10%胎牛血清）培养，将细胞置于二氧化碳培养箱中培养，细胞融合率达80%后，胰蛋白酶消化处理并传代培养。将细胞分为空白对照组、高浓度组、低浓度组，其中空白组在处理时采用空白培养基培养，高浓度组细胞在处理时采用100 μg/mL浓度三叶青黄酮干预，低浓度组采用50 μg/mL浓度三叶青黄酮干预。

1.3 细胞生物学行为检测

1.3.1 细胞增殖活性检测  取对数生存期T24细胞，接种于96孔板中，依照分组分别使用空白培养基和三叶青黄酮干预，培养24 h后每孔20 μL ，MTT（5 mg/mL），细胞培养箱中孵育4 h后将上清弃去，加入150 μL 二甲基亚砜，振荡避光处理10 min，使用酶标仪检测各孔波长490 nm处吸光度值（OD490），计算各组细胞增殖活性，细胞增殖率=（OD实验组-OD空白组）/（OD对照组-OD空白组）-1。

1.3.2 细胞凋亡活性检测  取对数生存期T24细胞，接种于6孔板中，依照分组分别使用空白培养基和三叶青黄酮干预，细胞培养箱中孵育24 h，利用胰酶消化制备单细胞悬液，磷酸盐缓冲溶液洗涤3次，加入Propidium Iodide和Annexin V-FITC避光孵育15 min，采用流式細胞仪检测细胞凋亡率。

1.3.3 Hoechst 33258 荧光染色  取对数生存期T24细胞，接种于96孔板中，依照分组分别使用空白培养基和三叶青黄酮干预，细胞培养箱中孵育24 h，将培养基弃去，加入固定液处理10 min，使用磷酸盐缓冲溶液洗涤3次，加入Hoechst 33258 荧光染色避光孵育5 min，显微镜下490 nm激发光下观察细胞核形态。

1.3.4 细胞迁移和细胞侵袭  取对数生存期T24细胞，接种于Transwell上室中，其中细胞迁移不使用Matigel基质胶包被小室，细胞侵袭使用Matigel基质胶包被小室，后依照分组在Transwell小室上室分别使用空白培养基和三叶青黄酮干预，下室加入600 μL RPMI 1640完全培养基，细胞培养箱中孵育24 h，将培养基弃去，使用4%多聚甲醛固定10 min，将甲醛丢弃，结晶紫染色3 min，将未穿过小室膜细胞擦除，使用显微镜对细胞进行计数，计算细胞迁移率和细胞侵袭率，细胞迁移率=（划线宽度-迁移后宽度）/划线宽度×100%，细胞侵袭率=侵袭细胞数/细胞总数×100%。

1.3.5 western blot检测  取对数生存期T24细胞，接种于96孔板中，依照分组分别使用空白培养基和三叶青黄酮干预，后细胞培养箱中孵育24 h，将培养基弃去，使用细胞裂解液制备细胞蛋白，采用BCA法测定细胞蛋白含量，使用SDS-PAGE电泳法分离蛋白，利用恒流法将蛋白转至PVDF膜上，加入PI3K、Akt、p-Akt、eNOS、β-actin一抗抗体孵育过夜，使用TBST洗涤3次，采用二抗抗体孵育2 h后，采用ECL发光液处理，使用天能显影仪检测。

1.4 统计学方法

采用SPSS 20.0和Graphpad软件行统计学分析，采用均值±标准差表示计量资料，利用方差检验分析多组间计量资料差异，使用ImageJ软件分析westernblot检测图，采用Flowjo软件分析流式细胞术检测结果，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞增殖检测结果

本组研究结果显示，空白组、低浓度组和高浓度组T24细胞增殖活性存明显差异，其中高浓度组细胞增殖活性最低，且组间两两比较均存在统计学意义（P<0.05）。见表1。

2.2 细胞凋亡检测结果

本组研究结果显示，空白组、低浓度组和高浓度组T24细胞凋亡活性存在明显差异，其中高浓度组细胞凋亡活性最高，且组间两两比较均存在统计学意义（P<0.05）。Hoechest染色结果显示，空白组细胞细胞核相对较为完整，且颜色均一，低浓度组和高浓度组细胞细胞核出现坍缩，出现裂解碎块并可见凋亡小体，且随给药浓度增高，细胞凋亡越高。见表2和封三图2。

2.3 细胞迁移和侵袭率检测结果

本组研究结果显示，空白组、低浓度组和高浓度组T24细胞迁移和侵袭活性存在明显差异，其中高浓度组细胞迁移和侵袭活性最低，且组间两两比较均存在统计学意义（P<0.05）。见表3。

2.4 细胞PI3K/Akt-eNOS信号通路检测结果

本组研究结果显示，空白组、低浓度组和高浓度组T24细胞PI3K、p-Akt、eNOS水平存在明显差异，其中高浓度组细胞PI3K、p-Akt、eNOS水平最低，且组间两两比较均存在统计学意义（P<0.05）。见表4。

3 讨论

膀胱癌是现阶段临床中最为常见的泌尿系统恶性肿瘤，目前临床中在对膀胱癌患者进行治疗时主要采用化疗方案进行干预治疗，但常规化疗方案由于其存在较大的不良反应，且膀胱癌细胞易产生耐药性，導致患者化疗效果较差，导致患者易出现复发[9]。因此，目前临床中采用包括三叶青在内的传统中药对患者进行辅助治疗，实现直接杀肿瘤细胞、增强化疗药物的效果，并通过辅助化疗可降低患者不良反应，降低膀胱癌患者治疗后复发率，提高膀胱癌患者生存率，已成为目前临床研究热点[10]。

黄酮是三叶青中十分重要的药理活性成分，有研究指出三叶青黄酮具有较好的抗炎作用，且对肿瘤细胞增殖也具有良好的抑制效果[11]。三叶青黄酮属于黄酮类化合物，其具有多种生物学效应，研究发现三叶青黄铜具有明确的抗炎症、抗氧化和抗肿瘤等药理作用[12]。有学者指出，三叶青黄酮可通过降低细胞侵袭和迁移，抑制细胞增殖，促进细胞凋亡等实现抑制肿瘤生长作用[13]。此外，三叶青黄酮还具有副作用小、毒性低、抗肿瘤谱宽特点，是潜在的具有广泛应用前景的抗肿瘤药物之一[14]。但目前针对三叶青黄酮对肿瘤的影响研究多集中在肝癌和胃癌等领域，其对膀胱癌细胞生物学行为的影响以及其作用机制目前仍未见报道[15]。本组研究结果显示，膀胱癌细胞使用三叶青黄酮干预治疗后，可有效抑制T24细胞增殖，促进细胞凋亡，加速细胞核坍缩，并降低肿瘤细胞迁移和侵袭能力。结果提示，三叶青黄酮对膀胱癌也具有明确的抗肿瘤作用，抑制肿瘤细胞增殖，与前人研究结果基本类似，但其作用机制尚未明确。

PI3K是目前已知的重要的原癌基因之一，其属于磷脂酰肌醇与肌醇的重要的激酶。生理状态下，PI3K存在两种激活形式，一种是通过p110和Ras结合活化PI3K，另一种使用通过与连接蛋白或酪氨酸残基的生长因子受体磷酸化并相互作用，改变二聚体构象而被激活[16]。有研究指出，PI3K活化后会使Akt转位至细胞膜，并催化Akt发生自身磷酸化而被激活[17-18]。PI3K/Akt信号通路激活后，会引起细胞内p-Akt水平升高，继发导致细胞中并参与肿瘤细胞的翻译、转录、代谢、细胞周期、凋亡、血管新生等多种生理或病理过程的调控[19]。有研究指出，在膀胱癌患者体内可见膀胱癌病变组织中PI3K/Akt通路呈异常激活状态[20]。本组研究结果显示，采用三叶青黄酮干预后可有效降低膀胱癌细胞中Akt蛋白磷酸化水平，有效降低细胞中PI3K和eNOS水平，结果表明，使用三叶青黄酮干预后可有效抑制PI3K/Akt-eNOS信号通路。且基于本组研究结果推测认为，三叶青黄酮可通过调节膀胱癌细胞中PI3K/Akt-eNOS信号通路实现抑制细胞增殖、侵袭和迁移，促进肿瘤细胞凋亡而起到对抗膀胱癌的作用。

综上所述，三叶青黄酮可通过调节PI3K/Akt-eNOS信号通路实现抑制膀胱癌细胞增殖、迁移和侵袭，促进细胞凋亡。但本研究并未对三叶青黄酮处理后膀胱癌细胞内的基因水平差异进行探讨和分析，有待后续继续分析。

[参考文献]

[1] WenfengL，Jinlin X，Naijin X，et al. Glaucocalyxin A induces G2/M cell cycle arrest and apoptosis through the PI3K/Akt pathway in human bladder cancer cells[J]. International Journal of Biological Ences，2018，14（4）：418-426.

[2] Ke-Wang，Luo，Wing-Yin，et al. EGCG inhibited bladder cancer T24 and 5637 cell proliferation and migration via PI3K/AKT pathway[J]. Oncotarget，2018，9（15）：12261-12272.

[3] 姚佳沛，徐建春，刘炜，等.雌激素受体β在膀胱癌中的表达及对膀胱癌细胞侵袭、迁移的影响[J].中国免疫学杂志，2019，35（20）：2494-2498，2503.

[4] Xiang-Ping L，Han-Jin C，A-Li Y，et al. Astragaloside IV Improves Vasodilatation Function by Regulating the PI3K/Akt/eNOS Signaling Pathway in Rat Aorta Endothelial Cells[J]. Journal of Vascular Research，2018，55（3）：169-176.

[5] Zhuo D，Wu Y，Luo J，et al. CSTP1 inhibits IL-6 expression through targeting Akt/FoxO3a signaling pathway in bladder cancer cells[J]. Experimental Cell Research，2019， 380（1）：80-89.

[6] Lv S，Wang W，Wang H，et al. PPARγ activation serves as therapeutic strategy against bladder cancer via inhibiting PI3K-Akt signaling pathway[J].BMC Cancer，2019， 19（1）：204-211.

[7] 吳海英，吴元庭，陈优优，等.三叶青黄酮诱导髓系白血病NB-4细胞凋亡及信号通路的研究[J].中国病理生理杂志，2019，35（8）：1451-1456.

[8] Chen W，Huang C，Yang C，et al. Danggui Sini Decoction Protected Islet Endothelial Cell Survival from Hypoxic Damage via PI3K/Akt/eNOS Pathway[J]. Evidence-based Complementary and Alternative Medicine，2018，2018（5）：1-10.

[9] 金乾，武跃清，秦克松，等.浅表性膀胱癌经尿道膀胱肿瘤电切术联合丝裂霉素C及干扰素治疗效果与复发原因[J].中国临床医生杂志，2018，46（1）：65-67.

[10] BizhaniF，Hashemi M，Danesh H，et al. Association between single nucleotide polymorphisms in the PI3K/AKT/mTOR pathway and bladder cancer risk in a sample of Iranian population[J]. Excli Journal，2018，17（2）：3-13.

[11] Xu J，Qin N，Yao Y，et al. Geraniin inhibits bladder cancer cell growth via regulation of PI3K/AKT signaling pathways[J]. Tropical Journal of Pharmaceutical Research，2020，19（2）：253-257.

[12] 张鹏，杨杰，高翔，等.黄酮类化合物抗炎作用及其作用机制研究进展[J].畜牧与兽医，2018，50（2）：134-137.

[13] Liang D，Fan L，Wanjun W，et al. Verteporfin inhibits YAP-induced bladder cancer cell growth and invasion via Hippo signaling pathway[J].International Journal of Medical Sciences，2018，15（6）：645-652.

[14] Li X，Teng S，Zhang Y，et al. Correction： TROP2 promotes proliferation，migration and metastasis of gallbladder cancer cells by regulating PI3K/AKT pathway and inducing EMT[J]. Oncotarget，2019，10（60）：6540-6546.

[15] 张胜强，张洪艳，齐宝林，等.三叶青黄酮诱导肺癌SPC-A-1细胞凋亡与cleaved-caspase-3表达的关系[J].中国医院药学杂志，2017，37（12）：1139-1143，1148.

[16] Lee J H，Parveen A，Do M H，et al. Lespedeza cuneata protects the endothelial dysfunction via eNOS phosphorylation of PI3K/Akt signaling pathway in HUVECs[J]. Phytomedicine，2018，48（1）：1-9.

[17] Zhang Q，Lyu W，Yu M，et al. Sulfur dioxide induces vascular relaxation through PI3K/Akt/eNOS and NO/cGMP signaling pathways in rats[J]. Human & Experimental Toxicology，2020，39（8）：142-151.

[18] Sun M，Zhao W，Chen Z，et al. Circular RNA CEP128 Promotes Bladder Cancer Progression by Regulating Mir5/Myd88 Via Mapk Signaling Pathway[J]. International Journal of Cancer，2019，145（8）：2170-2181.

[19] Teng，Hou，Lijie，et al. Correction： CLCA4 inhibits bladder cancer cell proliferation，migration，and invasion by suppressing the PI3K/AKT pathway[J]. Oncotarget，2019， 10（9）：1010-1017.

[20] Shipeng，Zheng，Peihua，et al. Overexpression of CBX2 in breast cancer promotes tumor progression through the PI3K/AKT signaling pathway[J]. American Journal of Translational Research，2019，11（3）：1668-1682.

（收稿日期：2021-01-02）