1例羊源肺炎克雷伯菌和大肠杆菌混合感染的诊断

马 凤

（甘肃省靖远县畜牧兽医技术服务中心，甘肃靖远 730900）

近些年来，肺炎克雷伯菌逐渐在羊身上被发现，发展速度较快，对羊养殖产生了重要影响。大肠杆菌又称为大肠埃希菌，这种细菌在肠道内正常存在，但一些血清型的大肠杆菌会引发动物机体发生抵抗力低下，导致腹泻或败血症的发生[1～3]。本研究对这两种细菌混合感染进行分析，以便兽医能更好地对患病山羊进行治疗。

1 材料与方法

1.1 一般材料

患羊病症为眼部红肿，在放牧的过程中出现神经性问题，不吃青草。本次实验中应用的试剂为血平板培养基、肠杆菌科细菌生化鉴定管（青岛高科技工业园海博生物技术有限公司）、麦康凯类琼脂培养皿，使用16s rDNA Bacterial Identification PCR Kit试剂盒（宝生物工程有限公司生产），大肠杆菌诊断血清（天津生物芯片诊断）。

1.2 方法

1.2.1 对山羊病变组织急性处理

对山羊病变的部位进行剖检，病羊剖检部位出现肺部淤血伴有坏死，心外膜增厚，肝脏肿大伴有坏死，病羊腹腔坏死，心脏外的薄膜厚度增加，其他组织有缺血情况，病羊肠道内出血。

1.2.2 细菌培养

对病羊体内细菌进行分离培养，采用接种环对病羊体内病变的器官内的组织进行挑选，使用麦康凯的平板进行划线处理，将培养皿放置在恒温箱中，温度维持在37℃，培养时间16 h以上。

1.2.3 染色鉴定

染色鉴定的方法主要采用革兰氏染色。对培养皿中的菌落进行挑选，将疑似患病的组织菌落固定在一处，采用结晶初染，滴加碘液，滴加时间控制在1 min，滴加乙醇和沙黄水溶液，时间控制在0.5 min，上述操作完成后进行吸干和镜检操作。

1.2.4 生化方面的试验

抽取2只病羊血样进行测验，诊断肠杆菌科，主要采用玻璃板对菌株1、2进行相关鉴定。

1.2.5 对血清型进行鉴定

将病羊中的菌株1、2使用大肠杆菌进行诊断，主要采用血清玻璃板凝集的方式进行鉴定。

1.2.6 16S rRNA 测定基因序列的方法

主要方法步骤为：将纯化完成的菌液煮沸，提取DNA，并将其作为模板，采用16s rDNA Bacterial Identification PCR Kit试剂盒对其中通用的物质进行扩充，测定基因序列，并将测试结果上传至数据库中进行全面分析。

1.2.7 药敏试验

使用灭菌棉签将纯化完成的菌液均匀涂抹在培养皿中，再使用灭菌镊子将药敏纸片贴于培养皿上，随后将其放置于培养箱内，温度保证在37℃，保存1 d左右，培养完成后，使用小尺测量培养菌圈的直径。

2 结果

2.1 培养皿中细菌呈现的形态

菌株1在培养皿中通过麦康凯进行培养形成圆形状态，表现为光滑状态，且菌株培养较为湿润，边缘较为齐整，呈现红色状态。菌株2呈现状态与菌株1相同，但呈灰白色，且颜色较浅，菌株较小。

2.2 革兰氏染色情况

使用光学显微镜观察菌株1发现，呈粉红色直杆菌，且直杆菌呈现菌体较大的情况，菌体两端为钝圆，且成对出现。菌株1和菌株2在革兰氏染色处理下情况相同。

2.3 两组生化试验情况对比

菌株1中，与伯杰氏细菌进行对比，发现其属于大肠杆菌。菌株2与肺炎克雷伯菌情况相同（见表1）。

表1 两组菌株生化试验情况

2.4 血清型鉴定和16S序列测定

对菌株1和菌株2进行血清型鉴定，经大肠杆菌诊断，其血清及玻璃板凝集试验出现大肠杆菌为菌株1，血清型为020，菌株2PCR的扩增使用产物为1800 bp。

2.5 两组药敏试验结论

对菌株1、2两组进行24种药物药敏反应，测试结果显示：大肠杆菌对头炮素类药物有药敏反应，对苯唑啉高敏感（见表2）。

表2 两组菌株药敏情况（mm）

3 讨论

肺炎克雷伯氏菌可引发羊等动物肺部炎症，造成脑出血。因此，兽医应及时进行实验室检测，进行确诊，采取科学的防治措施，降低养殖户的经济损失。这种细菌检测方法主要通过细菌培养进行，如采用16s rDNA进行诊断准确度较高，但需在实验室进行，有一定的局限性。

大肠杆菌是一种传染性较高的病菌。当羊舍卫生条件不达标、生长环境差、羊舍温度控制不好、饲喂不科学导致羊胃肠功能下降时可引发病变，传播速度快，传播能力强，一旦发病影响较大[4]。

本研究通过药敏试验发现两组细菌情况较为相似；通过血清监测发现血清型O2O对羊致病性等于0；药敏试验发现，两种细菌对喹诺酮类药物敏感性较强，可采用诺氟沙星药物对患羊进行预防或治疗。治疗羊源性感染时，应根据药敏试验的敏感程度，选择敏感性较强的药物进行治疗，保证治疗效果。