膝关节骨关节炎相关炎症及软骨代谢标志物的表达与临床意义

黄远 刘日光 张沕 董亮宏 杨嘉飞 石豪 王爱民 杨正杰 李光第*

1.铜仁市人民医院骨科，贵州 铜仁 554300 2.贵州医科大学附属医院骨科，贵州 贵阳 550004 3.黔东南州人民医院骨科，贵州 凯里 556000

膝关节骨关节炎(knee osteoarthritis，KOA)是常见的慢性骨关节疾病，因现有诊断方法的局限性，临床上很难发现最早期KOA，当患者因各种不适就诊时，膝关节已经发生了不可逆性损伤。因此，深入研究KOA发病机制，寻找到有效的治疗靶点，早期诊断已成为医学上亟待解决的问题。KOA的发病有一个“沉默期”，在此期间患者没有任何临床症状，影像学检查也没有异常，但关节组织已经发生广泛的代谢改变[1-2]。生物标志物(Biomarker，BM)是指能客观测量并且可以评估正常生理代谢过程、病理变化以及治疗效果的生化指标[3-4]。在影像学改变之前，血液、尿液及关节液等体液组织中的BM能够动态地反映关节组织代谢状况，评估关节组织病变程度，已经得到国内外学者的认可[5-7]。监测体液BM的变化情况，及时发现早期病变并采取有效治疗措施，这将对KOA早期诊断、病程监测以及疗效评估起到积极的指导作用[8-9]。KOA的病理生理变化，尤其是局部炎症反应及关节软骨的破坏是骨科领域研究的热点，有研究者提出单一生物标志物的检测灵敏度相对较差，若能将几项标志物联合检测，可更加准确地反映病变情况[10-11]。

本研究以KOA患者为研究对象，采集血清、尿液、关节液以及关节软骨标本，联合检测COMP、MMP-13、Cbf-β的表达情况。本研究采取自愿参与的原则且通过贵州医科大学附属医院伦理委员会审批，批件号：2018伦审(15)号。并在中国临床试验注册中心(Chinese clinical trial registry，ChiCTR)注册登记，注册号：ChiCTR1800017066。

1 材料与方法

1.1 体液部分

1.1.1一般资料：纳入2018年6月至2019年1月贵州医科大学附属医院骨关节外科收治，行人工全膝关节置换的KOA患者22例为试验组。纳入同期行关节腔注射治疗的KOA患者22例为对照组。纳入健康志愿者18例为健康对照组。

1.1.2纳入排除标准：纳入标准：①符合KOA的诊断标准[12-13]；②既往无膝关节感染及手术外伤史；③既往无关节穿刺及注射治疗史；④无激素、免疫抑制剂等药物服用史；⑤没有严重的系统性疾病且肝、肾功能无明显异常。排除标准：①肿瘤、结核等慢性消耗性疾病；②痛风、类风湿性关节炎等其他类型骨关节疾病；③先天性因素所致膝关节畸形及功能障碍；④患有精神类疾病不能配合研究者；⑤不同意参与试验及未签署知情同意书的患者。

1.1.3实验方法：血清、尿液、关节液标本采集后分装于1.5 mL EP管，冻存于-80 ℃冷库。采用酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)测定标本中COMP、MMP-13、Cbf-β的表达情况。COMP、MMP-13试剂盒购于武汉华美公司，Cbf-β试剂盒购于上海酶联生物科技有限公司。具体操作步骤如下：①标准品加样：设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品 50 μL；②加样：分别设空白孔和待测样品孔。在待测样品孔中先加样品稀释液40 μL，然后再加待测样品 10 μL；③加酶：每孔加入酶标试剂 100 μL，空白孔除外；④温育60 min；⑤配液：将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用；⑥洗涤：每孔加满洗涤液，静置 30 s后弃去，如此重复5次；⑦显色：每孔先加入显色剂A 50 μL，再加入显色剂B 50 μL显色15 min；⑧终止：每孔加终止液50 μL，终止反应(蓝色立转黄色)；⑨测定：以空白孔调零，450 nm 波长依序测量各孔的吸光度(OD 值)。

1.2 软骨组织部分

1.2.1一般资料：纳入2018年6月至2019年1月贵州医科大学附属医院骨关节科收治，行人工全膝关节置换术的KOA患者22例为试验组，纳入同期外伤急诊截肢患者8例为对照组。纳入排除标准同第一部分，正常对照组软骨取自年龄大于18岁急诊截肢患者，排除KOA或关节慢性疼痛病史，既往无膝关节外伤、感染、手术等情况。

1.2.2试验方法：采集膝关节软骨组织标本，观察其大体结构并做好记录，取胫骨平台全层软骨，成块状取下，置于5 mL EP管，4%多聚甲醛浸泡固定。另一部分成片状切下，置于5 mL EP管，-80 ℃冷库冻存。通过番红O固绿染色观察软骨组织病变情况，应用免疫组化法检测软骨组织Ⅱ型胶原表达情况。应用免疫印迹蛋白定量法(Western Blot)检测软骨组织COMP、MMP13、Cbf-β蛋白的表达情况。

1.2.3主要实验试剂与仪器：番红-固绿染色试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)，即用型免疫组化二抗试剂盒(福州迈新生物技术开发有限公司)，COMP、MMP-13、Cbf-β抗体(北京博奥森生物技术有限公司)，β-actin抗体(Abclonal公司)，EDTA脱钙液(北京雷根生物技术有限公司)，微量移液器(Eppendorf公司)，冷冻离心机(Thermo公司)，漩涡振荡仪(Labnet公司)，电泳仪(Bio-rad公司)、垂直电泳槽(Bio-rad公司)、化学发光成像系统(Bio-rad公司)。

1.2.4实验步骤：(1)番红O固绿染色：将固定的软骨组织块EDTA脱钙液脱钙后，石蜡包埋、切片，入固绿染色液内浸染5 min弱酸溶液洗涤后，入 Safranin O stain 内浸染 5 min，显微镜镜检，图像采集分析。(2)Ⅱ型胶原免疫组化：将固定的软骨组织行免疫组织化学染色。具体操作步骤如下：①石蜡切片脱蜡；②抗原修复：组织切片置于修复盒中于微波炉内进行抗原修复；③阻断内源性过氧化物酶：切片放入3%过氧化氢溶液孵育25 min；④BSA或者血清封闭：用组化笔在组织周围画圈，在圈内滴加用3%BSA均匀覆盖组织，封闭30 min；⑤孵育一抗，再使用二抗；⑥DAB显色：滴加DAB显色液，阳性为棕黄色；⑦复染细胞核；⑧脱水封片；⑨显微镜镜检，图像采集分析。采用Image Pro-Plus 6.0软件，分析每张片子阳性细胞的累计光密度值(IOD)。(3)蛋白水平Western Blot 检测：将冻存的软骨组织在液氮中研磨后提取蛋白，BCA 法测定各组蛋白浓度。根据测定的蛋白含量作为参照，每个胶孔加入等量蛋白，再以β-actin为参照验证蛋白含量。重复实验调整蛋白上样量使其一致，使用统一蛋白上样量进行SDS-PAGE，每个蛋白上样40 μg进行SDS-PAGE，转膜，孵育一抗，再使用二抗，以Bio-Rad化学发光成像系统显色，结果使用Image J 2X软件对Western-Blot条带进行半定量，分析其读数，最后以β-actin作为内参计算样本的相对表达量。

1.3 统计学分析

采用SPSS 25.0软件进行统计分析，计量资料比较采用独立样本t检验或单因素方差分析，计数资料比较采用卡方检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 体液部分试验结果

2.1.1一般资料比较：见表1。

表1 体液部分各组基线资料比较Table 1 Comparison of baseline data of body fluid between each group

2.1.2血清标本检测结果：三组受试者血清中均检测到COMP、MMP-13、Cbf-β的表达，各因子在健康对照组、试验对照组、试验组间的表达均逐渐增高，经单因素方差分析，COMP、MMP-13、Cbf-β在试验组、试验对照组以及健康对照组血清的表达差异有统计学意义(P=0.001、0.001、0.001)。见图1。

图1 各组血清标本BM检测结果Fig.1 Detection results of BM in serum samples of each group注：*P<0.05，**P<0.01。

2.1.3尿液检测结果：三组受试者尿液中均检测到COMP、MMP-13的表达，各因子在健康对照组、试验对照组、试验组间的表达均逐渐增高，经单因素方差分析，COMP、MMP-13在试验组、试验对照组以及健康对照组尿液的表达差异有统计学意义(P=0.001、0.001)。见图2。

图2 各组尿液标本BM检测结果Fig.2 Detection results of BM in urine samples of each group注：*P<0.05，**P<0.01。

2.1.4关节液检测结果：三组受试者关节液中均检测到COMP、MMP-13、Cbf-β的表达，各因子在健康对照组、试验对照组、试验组间的表达逐渐增高，经单因素方差分析，COMP、MMP-13、Cbf-β在试验组、试验对照组以及健康对照组关节液的表达差异有统计学意义(P=0.001、0.001、0.001)。见图3。

图3 各组关节液标本BM检测结果Fig.3 Detection results of BM in synovial fluid samples of each group注：*P<0.05，**P<0.01。

2.2 软骨组织试验结果

2.2.1一般资料比较：见表2。

表2 软骨组织各组基线资料比较

2.2.2番红O固绿染色结果：番红O固绿染色可见对照组软骨基质红染均匀，软骨下骨呈绿色，软骨与软骨下骨界限清楚，结构整齐。实验组软骨结构层次紊乱，软骨基质染色较淡，并且红染范围小，提示试验组病变膝关节软骨基质破坏、减少；而绿染范围大，提示试验组膝关节软骨病变较重。见图4。

图4 软骨组织番红O染色结果Fig.4 Results of Safranin O fast green staining in the cartilage

2.2.3免疫组化结果：试验组软骨组织Ⅱ型胶原蛋白的表达较对照低，经独立样本t检验，Ⅱ型胶原蛋白在试验组与对照组的表达差异有统计学意义(P=0.001)。见图5。

图5 软骨组织Ⅱ型胶原表达情况Fig.5 Expression of type II collagen in the cartilage注：*P<0.05，**P<0.01。

2.2.4Western Blot检测结果：试验组软骨组织COMP、MMP-13、Cbf-β的表达均高于对照组，经独立样本t检验，COMP、MMP-13、Cbf-β在试验组与对照组的表达差异有统计学意义(P=0.001、0.002、0.002)。见图6。

图6 软骨组织BM表达情况Fig.6 Expression of BM in the cartilage注：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

3 讨论

血液、尿液及关节液内生物标志物的变化可反映KOA的病变严重程度，预测疾病的进展，近年来引起广大医学研究人员的重视[14-15]。致病因素的持续存在使软骨代谢发生改变时，软骨基质合成与分解代谢的动态平衡被打破，其代谢过程中的小分子产物是生物标志物最丰富的来源[16]。

血清COMP可作为OA病变的特异性生物标志物，辅助OA的早期诊断，并且在预测疾病快速进展的危险性方面有一定的参考价值[17-18]。Kluzek等[19]研究表明，血清COMP可以预测KOA的发生发展，并且独立于年龄和BMI等发病高危因素。MMP-13是最有效的Ⅱ型胶原降解酶，可有效降解软骨基质，促进软骨病变的进展，有研究表明MMP-13在KOA患者血清高表达，其表达含量与膝关节病变严重程度呈正相关[20-21]。也有研究报道在KOA患者血清中同时检测到COMP与MMP-13的高表达，与K-L分级、WOMAC评分呈正相关，提示血清COMP和MMP-13联合测定可动态监测KOA膝关节病变的进展，在早期诊断、病情评估等方面有一定的参考意义[22]。有文献指出Cbf-β可能通过增强Runx2与DNA结合及转录活化也参与到骨性关节炎的病变调控[23-24]，本研究在KOA患者及健康志愿者血清中检测到了Cbf-β的表达，KOA患者明显高于健康志愿者，同COMP与MMP-13一致，在病变较重的试验组高于病变较轻的试验对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。提示血清Cbf-β可能是KOA潜在的生物标志物，对于KOA的早期诊断及病情评估有一定的参考价值，联合检测血清COMP、MMP-13、Cbf-β的表达，可能更准确地反映KOA患者膝关节软骨的病变进展程度。

既往对于KOA相关生物标志物的研究多集中在血清及关节液，而关于尿液生物标志物的研究较少，因其获取简单并且无创采集的特点，使得尿液生物标志物研究越来越受到重视。有学者指出尿液蛋白质组学的研究有助于更好地了解身体的动态变化并识别潜在的疾病特异性生物标志物[25-26]，其代谢产物的改变可以反映组织器官的代谢状况[27]。有文献指出COMP及CTX-II在KOA患者尿液中高表达，其含量随K-L分级的增加而逐渐升高，可作为KOA诊断及严重程度评估的参考标志物[29]。本研究在KOA患者尿液中检测到COMP、MMP-13的高表达，KOA患者明显高于健康志愿者，并且试验组表达高于试验对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。提示尿液COMP、MMP-13可能在KOA的早期诊断，病情评估具有重要的参考意义。

关节病损后组织结构以及细胞代谢的变化可以通过关节液的变化来体现[30]。KOA软骨病变后相关代谢产物直接释放于关节液，关节液内代谢相关标志物的变化可以灵敏地反映关节软骨的病理变化[31]。研究表明KOA患者关节液内COMP的表达与病变程度以及疾病进展有一定的相关性，可作为OA的诊断性标志物[32]。也有文献表明在KOA患者关节液内检测到COMP的高表达，表达水平与关节损伤的影像学表现呈正相关，提示关节液COMP对KOA软骨破坏的监测有一定的参考价值[33-34]。MMP-13作为软骨基质有效的降解酶，在膝关节病变过程中起到了关键作用，Özler等[34]研究表明，重度KOA患者关节液内MMP-13的表达与WOMAC评分显著相关。本研究在试验组、试验对照组、健康对照组关节液中均检测到了COMP、MMP-13、Cbf-β的表达，KOA患者显著高于健康志愿者，并且试验组高于试验对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，提示关节液内COMP、MMP-13、Cbf-β的表达含量可能与KOA病变严重程度呈正相关性，可反映病变的严重程度。

软骨破坏是KOA的特征性病变，本研究在试验组及对照组软骨组织标本均检测到了COMP、MMP-13、Cbf-β的表达，试验组显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，提示COMP、MMP-13、Cbf-β可能参与了KOA病变进程，进一步验证了三者在血清、尿液、关节液内表达对疾病诊断、病情评估的参考意义。

综上所述，联合检测COMP、MMP-13、Cbf-β在血清、尿液、关节液及关节软骨的表达，有助于KOA的早期诊断，也可为病变严重程度的评估提供参考依据。但是在软骨部分的试验结果中，两组在年龄因素比较中差异有统计学意义，分析原因如下，受疾病好发人群的年龄限制，在临床中行人工全膝关节置换术的KOA患者和同期外伤急诊截肢患者相比年龄偏大，尽管正常对照组仅纳入年龄大于18岁的患者，但因可取材患者有限，难以消除统计学差异。且本研究仅以贵州医科大学附属医院就诊的小部分KOA患者为研究对象，并且多数为病变较重，K-L分级Ⅲ级、Ⅳ级者，因此今后仍需多中心、大样本，纳入更多Ⅰ、Ⅱ级KOA患者的研究进一步探讨。