淫羊藿苷介导MAPK信号通路防治骨质疏松的研究进展

王敬博 陈跃平 章晓云 廖建钊

1.广西中医药大学，广西 南宁 530001 2.广西中医药大学附属瑞康医院创伤骨科与手外科，广西 南宁 530011

传统医学认为OP属于骨痿的范畴，《素问》中提出：“肾主骨，肾精充足则骨坚，若肾气不足则骨痿。”故认为肾气虚是OP发生的主要原因。当前中医药治疗OP常以淫羊藿等补肾药物为主[1]。淫羊藿为毛莨目小蘗科多年生草本植物，又名仙灵脾、铁打杵，《本草纲目》称：“其可益精气，强筋骨，利小便”，在临床上主要治疗阳痿遗精、筋骨痿软、筋脉拘挛等症。现代研究发现[2]，淫羊藿的主要药效成分淫羊藿苷(Icariin，ICA)具有促进骨形成、改善骨代谢平衡、增加骨密度等作用，其中成骨细胞(osteoblast，OB)与破骨细胞(osteoclast，OC)是参与骨形成和骨代谢的关键，维持OB和OC的相对稳定可确保骨的完整性和功能。研究表明[3]，丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)在骨细胞的形成、发育和凋亡过程中起着非常重要的作用，通常MAPK通路在ICA的激活作用下促进OB增殖、抑制OC分化及促进骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchyml stem cells，BMSCs)成骨分化，进而发挥抗OP的作用，见图1。因此，本文就ICA介导MAPK信号通路防治OP的作用机制作一综述。

图1 ICA介导MAPK信号通路治疗骨质疏松作用机制Fig.1 Mechanism of ICA mediated MAPK signaling pathway in the treatment of osteoporosis

1 MAPK通路

MAPK是信号由细胞外到细胞内的传递者，是一种具有磷酸化功能的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其活化受生长因子、氧化、激素等多种胞内和胞外信号刺激[4]。其中细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)、p38和c-Jun 氨基末端激酶(c-jun N-terminal kinase，JNK)3种激酶是MAPK的主要组成部分[5]，在将细胞外刺激转化为多种细胞反应的过程中起着关键作用[6]，其中JNK和p38 MAPK表达的变化在细胞受到各种物理、化学和生物应激刺激后最为显著，而ERK1/2信号主要激活细胞生长因子的表达，并在骨细胞的形成过程中有着至关重要的地位。

2 MAPK与骨细胞

目前维持骨代谢平衡是治疗OP的主要方法之一，其中维持OB骨形成和OC骨吸收水平稳定是确保骨代谢平衡的关键。在OP发生发展过程中，由于机体氧化应激水平不断升高，OB出现异常凋亡的现象，导致机体内骨稳态平衡被打破，然而机体内OC的活性增高，骨吸收功能亢进，也可打破骨形成与骨吸收之间的动态平衡。因此，降低机体氧化应激水平，维持OB的骨形成稳定，降低OC活性，抑制其骨吸收功能，可有效发挥抗OP作用[7-8]。另外，BMSCs也与人类的骨骼代谢密切相关，在转录因子和细胞因子的共同刺激下，可以促进BMSCs成骨分化，从而促进骨形成[9]。近年来发现，MAPK通路通过调控相关转录因子和基因的表达，促进OB和OC增殖、分化，促进BMSCs成骨分化以及调节BMSCs成脂分化，在骨形成和骨吸收中发挥着重要作用。具体机制研究如下。

2.1 MAPK与成骨细胞

MAPK通路中的ERK1/2、p38 MAPK和JNK在成骨基因表达过程中起着非常关键的作用，激活MAPK通路，可有效提高OB的活性并促进骨基质的分泌与钙化，利于机体骨形成。其中纤维细胞生长因子激活ERK1/2通路可显著促进OB增殖，而抑制ERK1/2信号通路的活化可降低Bax和Bel-2的表达，从而抑制Caspase-3的活化，遏制细胞凋亡。当p38 MAPK通路被激活后，OB中碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)的表达显著提升，从而诱导OB分化。JNK通路的激活也是OB分化的关键，当前列腺素E2、脂联素等激活JNK通路后，可显著促进OB增殖，因此激活MAPK信号通路是促进OB增殖、分化方式之一。Pratsinis等[10]指出hBMSCs向OB增殖、分化主要受ERK的激活，其中血小板衍生生长因子等骨活性剂均通过激活ERK信号通路促进OB增殖、分化。Greenblatt等[11]研究发现p38 MAPK通路是小鼠正常骨骼形成的必要条件，敲除MAPK通路成员编码基因Mkk3、Mkk6、p38a或p38b的小鼠则会出严重的骨量减少，通常表现为OB的分化缺陷，而在MAP3K家族中，p38上游的关键激活因子TGF-β活化激酶1往往也能促进OB的表达。Yang等[12]研究发现在OB分化过程中，由于JNK/MAPK磷酸化水平不断提高，阻断了成脂细胞转录因子表达，刺激了OB转录因子的表达，导致OB含量明显增多，利于机体骨形成。综上所述，OB的成骨基因表达与MAPK通路的激活作用密切相关，当MAPK通路激活后可促进OB增殖、分化(图2)。此外，OB是参与骨形成的关键，更深层次了解MAPK信号通路对OB的影响有助于更好地研究OP。

图2 MAPK信号通路与成骨细胞作用机制Fig.2 MAPK signaling pathway and the mechanism of osteoblasts

2.2 MAPK与破骨细胞

MAPK通路是OC形成的主要参与者，在OC分化过程中起主导作用。当ERK1/2通路受到激活作用后，可通过刺激c-Fos、c-Myc等下游转录因子调节OC分化。MKK3/MKK6磷酸化水平提高可激活p38 MAPK通路，并通过NFATc1促进OC分化。而JNK通路的活化常由细胞核因子-κB受体活化因子配体(receptor activator of NF-κB ligand，RANKL)与TRAF2和TRAF5相结合而引起，并可激活c-Jun/Fos活化蛋白1的表达，从而提高OC活性，促进OC增殖、分化。因此，寻找激活MAPK通路以刺激相关基因表达是促进OC增殖、分化的关键。研究表明[13]成熟OC存活周期受ERK通路调控，其中c-Fos基因蛋白的稳定表达可诱导骨髓巨噬细胞经过巨噬细胞刺激集落因子(macrophage colony-stimulating factor，M-CSF)促进NFATc1表达，并协同c-FMS在M-CSF刺激下通过ERK1/2和c-Fos信号通路介导OC分化。Tian等[14]认为酪氨酸磷酸化蛋白激酶p38 MAPK被激活后，可促进NFATc的表达，从而促进OC前体细胞分化为成熟OC。Huang等[15]研究发现唑来膦酸(zoledronic acid，ZOL)可降低RANKL诱导的JNK磷酸化，使OC的活性大大降低，从而抑制OC形成。这些结果提示，MAPK通路在激活作用下，OC的活性显著提高，从而促进OC分化，增强骨吸收功能(图3)。然而OP的发生与OC分化、骨吸收功能亢进有关，通常使用相关抑制剂，在MAPK信号通路的介导下抑制OC分化，降低其骨吸收功能，起到治疗OP的作用。

图3 MAPK信号通路与破骨细胞作用机制Fig.3 MAPK signaling pathway and the mechanism of osteoclasts

2.3 MAPK与骨髓间充质干细胞

BMSCs成骨受到激素、生长因子、培养环境等多种因素的影响，是骨再生的关键[16]。其中MAPK信号在BMSCs成骨及成脂分化中发挥关键作用，并以提高ERK和p38 MAPK的磷酸化水平来促进BMSCs成骨分化以及调节BMSCs成脂分化。梁军等[17]在探究复方接骨中药介导p38 MAPK信号通路对BMSCs成骨分化的影响中发现，中药通过提高p38蛋白磷酸化水平，上调MAPK通路的表达，从而促进 BMSCs成骨分化。朱波等[18]通过研究p38 MAPK磷酸化水平在15Hz 1 mT的电磁场下的变化，在应用ERK和p38 MAPK阻断剂之后，发现细胞内ERK和p38 MAPK磷酸化水平显著升高，BMSCs的ALP活性增强，证明通过活化ERK和p38 MAPK信号通路可以促进BMSCs的成骨分化。Jiang等[19]研究发现BMSCs中p-p38和p-JNK蛋白水平在骨诱导剂的刺激下显著提高，这提示p38和JNK通路活化对成骨分化具有积极作用。此外，长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)与p38 MAPK信号通路密切相关，其中lncRNA DANCR通过激活p38 MAPK通路可诱导BMSCs向OB分化。而p38 MAPK和ERK信号通路也参与调节脂肪细胞的形成，刘革修等[20]实验得出促红细胞生成素能够提高ERK42、ERK44、p38 MAPK磷酸化水平，降低过氧化物酶增殖体激活受体γ(peroxisome proliferators-activated receptor gamma，PPARγ)的表达，从而遏制BMSCs成脂分化。也有研究表明ERKl/2通路的活化能够促进成脂细胞分化，在BMSCs成脂细胞分化的早期，ERKl/2通过提高C/EBPα和PPARγ的磷酸化水平，以促进脂肪细胞分化[21]。综上所述，p38 MAPK和ERK通路不仅可以促进BMSCs成骨分化，还在BMSCs成脂分化中起到促进或抑制的作用(图4)。

图4 MAPK信号通路与骨髓间充质干细胞作用机制Fig.4 The mechanism of MAPK signaling pathway and bone marrow mesenchymal stem cells

3 淫羊藿苷与骨质疏松

3.1 淫羊藿苷介导MAPK通路促进成骨细胞增殖、分化

MAPK信号通路的激活是OB增殖、分化的主要促进因子，在骨形成中发挥着关键作用。因此寻找激活MAPK信号通路以促进OB增殖、分化的方法成为治疗OP的主要方法之一。当前研究发现淫羊藿的主要药效成分ICA能够激活MAPK信号通路以促进OB增殖、分化，从而促进骨形成，抑制OP的发生、发展。刘尚全等[22]发现糖皮质激素对OB的活性具有抑制作用，而ICA能够通过MAPK/ERK信号通路改变糖皮质激素对OB的抑制作用，通常情况下，由于受到ICA的刺激，p38 MAPK/ERK磷酸化水平提高，从而促进OB增殖、分化，促进骨形成。为了证实这一结论，龚一昕等[23]在实验中应用ICA Ⅱ来刺激p38 MAPK信号，发现p-p38 MAPK磷酸化水平与ALP活性明显提高，从而推测ICA Ⅱ能够激活MAPK通路的表达，刺激OB分化达到治疗OP的目的。因此，通过以上研究得出ICA介导MAPK信号通路可以促进OB增殖、分化，显著提高骨含量和骨密度。由此得出，以OB为靶点是治疗OP的主要方法之一，其具体作用机制仍需进一步研究。

3.2 淫羊藿苷介导MAPK通路抑制破骨细胞分化

淫羊藿的主要药效成分ICA是类黄酮化合物的一种[24]，它通过多种通路促进OB增殖，遏制OC分化，从而减少骨质流失，提高机体的骨含量与骨密度。其中MAPK通路是OC生成的主要参与者，在OC分化过程中通过c-Fos和NFAT等MAPK下游调控因子激活OC活性而产生。因此，当MAPK通路与类黄酮化合物相结合时，通过调控c-fos等基因表达，能够抑制OC分化，从而降低骨吸收作用。王想福等[25]应用体外培养OC的方法，探究类黄酮通过p38 MAPK/c-Fos信号通路对OC分化的影响，结果发现类黄酮能够抑制OC分化，并可下调p38 MAPK通路中c-Fos蛋白水平表达，从而遏制OC的骨吸收作用。Ohyama等[26]发现类黄酮化合物能抑制OC前体细胞向OC分化，从而阻断脂多糖诱导的骨性破坏。此外，ERK和JNK通路是OC分化的关键，而Sudachitin可阻断骨细胞内ERK和JNK通路的激活，发挥抑制OC分化的作用。因此，通过实验得出类黄酮可降低MAPK信号通路的活性来抑制OC分化，降低骨吸收功能，达到治疗OP的目的。而ICA是类黄酮化合物的一种，因此ICA抗OP的作用可能是经由MAPK通路介导的。

3.3 淫羊藿苷介导MAPK通路促进BMSCs成骨分化

目前研究发现BMSCs具有多方位分化功能，通常被广泛应用于组织工程中，但是BMSCs的迁移能力较差，限制了对骨细胞的修复效果，当ICA激活MAPK通路后可恢复BMSCs修复功能。同时，通过上调ELK1和c-Myc等MAPK下游转录因子，可促进BMSCs成骨分化，从而提高钙沉积面积，发挥抗OP的作用[27]。Qin等[28]通过实验证明ERK或p38 MAPK的特异性抑制剂能够阻断ICA诱导的蛋白激活，并显著降低BMSCs成骨分化，证实了ICA介导ERK和p38 MAPK促进BMSCs成骨分化的作用。由此可知，ICA通过MAPK通路能够促进BMSCs成骨分化，从而提高钙沉积面积，达到预防OP的目的。但笔者认为目前仍缺乏相关机制的实验研究，需进一步实验验证。

4 总结与展望

随着我国老龄化程度日益加重，骨质疏松症的患病人数呈现逐年上升趋势，这给个人、家庭和社会带来了严重的经济负担，为此深入研究OP的发生机制与抗OP的药物变得尤为重要。目前补肾中药淫羊藿在治疗OP方面取得了良好的临床效果，其主要药效成分ICA介导MAPK信号通路防治OP的有效作用机制也通过上述实验研究得到证实。因此，本综述将ICA与MAPK信号通路相结合，通过刺激MAPK通路来促进OB增殖分化，提高骨的钙化率；通过抑制OC分化，降低骨吸收；通过促进BMSCs成骨分化，加快钙盐沉积，从而达到防治OP的效果。然而BMSCs成脂分化增多也可诱导OP的发生，目前有研究表明ICA可通过Wnt信号通路促进BMSCs成骨分化、抑制成脂分化，进而发挥抗OP的作用。笔者研究发现ICA介导MAPK信号通路能够促进BMSCs成骨分化，而ICA能否介导MAPK信号通路抑制BMSCs成脂分化有待进一步研究。除此之外，ICA激活cAMP-PKA、NF-κB、Wnt等信号通路也可在OB、OC、BMSCs的增殖、分化以及凋亡过程中产生相应的影响，但其相关分子机制的研究还需加强完善。综上所述，尽管当前国内外仍缺乏ICA治疗OP的大量动物或临床样本的实验研究，但随着对ICA治疗OP机制研究的不断深入，ICA有望成为临床上防治OP疾病的关键药物。