白茅苷对去卵巢大鼠骨髓间充质干细胞功能和骨量的影响

赵王林 毕衡 孔俊博 马菲 许剑 王清 李智奎

云南省中医医院骨科，云南 昆明 650021

绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis，PMO)是由雌激素缺乏引起的以绝经后妇女骨密度和骨质量受损为特征的代谢性骨质疏松症[1-2]。骨质疏松症的重要临床特征是骨量、骨微结构和生物力学性能受损引起的慢性骨痛和骨折。这些症状会显著降低PMO患者的生活质量和功能能力。PMO现在已经成为一个涉及医学、社会和经济的全球公共卫生问题。目前对PMO治疗最有效的方案是使用抗骨质疏松药物进行干预，但是临床上常用二磷酸盐、雌激素等。

药物具有一些局限性和不良反应，包括血栓栓塞和胃肠道刺激[3]，因此需要开发新的药物用于治疗这类疾病。白茅苷(BMG)是一种线性的呋喃香豆素化合物，是从当归和其他中药成分中分离出来的。BMG是一种植物提取物，广泛可得且便宜，并且具有抗氧化和抗凋亡作用[4-5]。有研究表明BMG能促进MC3T3-E1细胞增殖和分化[6]。鉴于BMG对成骨细胞的影响，因此其可用于治疗骨质疏松；但是，BMG是否能发挥骨保护作用仍不确定。因此本研究通过BMG干预观察骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)向成骨细胞诱导分化及观察去卵巢大鼠骨量、骨密度以及骨强度影响，初步探索BMG预防和治疗绝经后骨质疏松症机制。

1 材料与方法

1.1 实验模型建立和治疗

本研究选用30只体重220～260 g，3月龄雌性SD大鼠，购自上海实验动物中心(中国上海)。每组5只大鼠饲养在一只笼子里，光照时间为12 h/d，温度为25 ℃，通风干燥；可以自由饮食。适应1周后，10只大鼠接受假手术(Sham)，其余大鼠行双侧卵巢切除术(OVX)。常规麻醉消毒后，腰3椎体周围1.5 cm处切开一条纵向切口，露出腹腔，OVX组大鼠切除双侧卵巢，Sham组打开腹腔后缝合腹腔。

手术3 d后进一步将大鼠分为3组(n=10只/组)：Sham组、OVX组、BMG组：去卵巢大鼠术后给予白茅苷[20 mg/(kg·d)，Sigma-Aldrich]灌胃治疗，而OVX组和Sham组的大鼠则给予相同体积的生理盐水；12周治疗结束时过量水合氯醛麻醉处死大鼠，获取双侧股骨进行进一步检测。

1.2 体外细胞研究

三组大鼠在手术12周后进行安乐死。通过用α-MEM冲洗从股骨中分离出BMSCs，并用红细胞裂解缓冲液去除红细胞。洗涤后，将细胞在标准培养液(含有10% FBS，100 U/mL青霉素和100 g/mL链霉素的α-MEM)中于75 cm培养瓶中于37 ℃，5% CO2。用0.25%胰蛋白酶-EDTA对大鼠原代BMSCs进行胰酶消化，然后重新铺板。后续实验中使用的所有细胞均为第2代。为了进行成骨分化，将各组大鼠的BMSCs在10个12孔板中以1×104细胞/cm2的密度培养。达到80%汇合后，将细胞在成骨培养基(含有10%FBS，10 mmol/Lβ-甘油磷酸酯，100 nmol/L地塞米松和50 g/mL L-抗坏血酸的DMEM)中培养21 d。每3 d更换成骨培养基；在成骨分化2周和3周后分别使用碱性磷酸酶(ALP)和茜素红(ARS)染色。将BMSCs固定在4%多聚甲醛(pH=7.4)中，并在0.1%ARS或者ALP溶液(pH=4.2)中于室温孵育15 min。使用Olympus IX51显微镜捕获数字图像。使用分光光度计在420 nm处测定吸光度。

1.3 蛋白质印迹(WB)检测

收集BMSCs并在放射免疫沉淀测定缓冲液(RIPA，Beyotime，中国上海)中裂解。离心后，使用BCA蛋白质测定试剂盒测量上清液中的蛋白质水平。将蛋白质样品上样进行电泳，然后转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上(Millipore，Billerica，MA，美国)。将膜在5%脱脂奶中封闭2 h，然后与BMP-2、Runx2、OPN、OCN、ALP、Col1和GAPDH一抗和二抗一起孵育。通过增强的化学发光(ECL)对条带进行曝光，并通过Image Software(版本X；Media Cybernetics，Silver Springs，MD，美国)进行分析。

1.4 Micro-CT和骨生物力学检测

使用Micro-CT系统(Skyscan 1176，Kontich，Belgium)检查股骨远端的微结构特性。骨扫描分辨率高(18 μm)，能量65 kV，385 A。采用NRecon v1.6和CTAn v1.13.8.1软件进行三维重建。感兴趣区(ROI)定义为股骨远端的松质骨。计算骨密度(BMD，g/cm3)和骨微观结构参数：骨体积比(BV/TV，%)、骨小梁数目(Tb.N，mm-1)、骨小梁厚度(Tb.Th，mm)和骨小梁间距(Tb.Sp，mm)。

Micro-CT检测后对大鼠股骨进行三点弯曲实验，将左侧股骨放在Instron 万能材料试验机力学测试装置上。将股骨放在支架的中间位置，以10 mm/min的持续测试速度加载直到股骨骨折。记录数据，最后通过Instron软件分析以获得最大载荷(N)和弹性模量(mm2)。

1.5 统计学分析

使用SPSS 20.0进行数据分析。结果使用均数±标准差；组间差异通过t检验进行分析；P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 BMG对BMSCs诱导向成骨细胞分化的作用

ALP和ARS染色如图1所示，OVX组大鼠BMSCs向成骨细胞分化后ALP和ARS染色阳性面积较Sham组明显降低(P<0.05)；而经过BMG治疗，BMG组大鼠BMSCs向成骨细胞分化后ALP和ARS染色阳性面积较OVX组明显增加(P<0.05)。

2.2 BMG对各组细胞蛋白表达影响

和Sham组比较，OVX组BMP-2、Runx2、OPN、OCN、ALP和Col1表达水平明显下调，比较差异有统计学意义(P<0.05)。和OVX组比较，BMG组BMP-2、Runx2、OPN、OCN、ALP和Col1表达水平上调，比较差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。

图2 使用WB检测BMP-2、Runx2、OPN、OCN、ALP和Col1的相对表达Fig.2 Relative expression of BMP-2, Runx2, OPN, OCN, ALP, and Col1 using Western blotting注：和Sham组比较，*P<0.05；和OVX组比较，#P<0.05。

2.3 Micro-CT分析

股骨干骺端骨小梁三维重建图像如图3A所示。股骨干骺端的微观参数如图3B～3F所示。OVX组股骨BMD、BV/TV、Tb.N和Tb.Th较Sham组明显降低，而Tb.Sp则明显升高(P<0.05)。BMG组左侧股骨BMD、BV/TV、Tb.N和Tb.Th均明显高于OVX组(P<0.05)，而Tb.Sp明显低于OVX组(P<0.05)。

图3 各组大鼠股骨干骺端Micro-CT检测结果Fig.3 Results of Micro-CT in the femoral metaphysis of each groups of rats注：A：各组大鼠骨小梁三维重建结果；B：Tb.Th；C：Tb.Sp；D：Tb.N；E：BV/TV；F：BMD；a：Sham组，b：OVX组，c：BMG组。和Sham组比较，*P<0.05；和OVX组比较，#P<0.05。

2.4 生物力学分析

股骨三点弯曲试验如图 4所示，OVX组的最大载荷和弹性模量均显著低于Sham组，两组间差异有统计学意义(P<0.05)，BMG组的最大载荷和弹性模量较OVX组明显升高(P<0.05)。

图4 股骨的三点弯曲试验结果Fig.4 Three-point bending test results of the femur of rats注：和Sham组比较，*P<0.05；和OVX组比较，#P<0.05。

3 讨论

由于具有分化为多种组织的能力，因此将BMSCs视为理想的干细胞[7]。在不同环境的刺激下，骨髓间充质干细胞可以被诱导成不同的细胞类型，包括成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、肌细胞和成纤维细胞[8]。通常，BMSCs的成脂和成骨分化在正常的骨稳态下保持动态平衡。一旦打破平衡，将遭受一系列疾病的困扰，例如骨质疏松症，这是由于成骨能力和骨质量的下降所致[9]。因此，研究成骨分化的潜在机制对预防骨丢失疾病具有重要意义。

在本研究中检测了不同治疗组大鼠BMSCs诱导分化为成骨细胞的能力，结果发现OVX组大鼠BMSCs成骨分化能显著降低，表现为ALP和ARS染色阳性面积较Sham组明显降低。而BMG组ALP和ARS染色阳性较OVX组明显升高；这表明BMG治疗能提高OVX大鼠BMSCs诱导分化为成骨细胞的能力。本研究还进一步测量了各组细胞中BMP-2、Runx2、OPN、OCN、ALP和Col1蛋白表达情况，这些蛋白是成骨相关的标记蛋白[10]。结果表明，这6个标志蛋白的表达均升高，表明由BMG组BMSCs的成骨分化较OVX组得到明显促进。这些数据表明BMG与BMSCs的成骨分化密切相关。

本研究大部分集中在与雌激素流失相关的骨骼变化上。骨质疏松症是一种代谢性疾病，其特征是骨骼质量和强度下降，导致脆性骨折[11]。尤其是骨小梁结构的破坏与骨强度降低和骨折患病率增加有关[12]。因此，本研究选择了BMD、骨小梁结构和骨生物力学参数改变作为骨质疏松治疗效果评价指标。本研究使用了一系列的研究方法来检查骨骼对BMG治疗的反应。骨密度测定数据证实，BMG在OVX大鼠模型中表现出骨保护作用。BMG治疗可防治骨小梁丢失。骨小梁变化与生物力学特性的改善(包括最大载荷和弹性模量)相吻合。此类生物力学和结构方面的改进表明，BMG治疗可增强骨骼质量。

在本研究中，通过BMG治疗可预防由OVX引起的骨量损失。BMG治疗显著改善OVX引起的骨小梁微结构性退化，表现为BV/TV、Tb.N、Tb.Th和Tb.Sp改变。BMG对骨骼的保护作用包括促进成骨作用，增加骨小梁数量和厚度及骨小梁连接性。这些发现证实了先前在补充BMG在OVX大鼠骨骼有益作用[13]。骨骼的生物力学分析可以提供有关骨骼强度特性[14]。骨骼的机械特性是骨折风险的最重要预测指标，而骨骼的强度则取决于骨骼质量和骨骼材料的固有特性[15]。在本研究结果中，BMG治疗有效增加股骨的最大载荷和弹性模量，表明BMG治疗对生物力学性能有很大影响，并保持了骨强度以防止卵巢切除术的有害作用。总的来说，骨小梁微观参数分析(Micro-CT)与骨密度和骨强度检测结果相一致。

总之，本研究表明BMG治疗可以阻止去卵巢大鼠骨密度、骨量及骨强度降低；同时可以促进去卵巢大鼠BMSCs成骨分化。但是没有从破骨细胞角度和骨代谢方面探讨BMG治疗效果，后续会进一步研究这方面变化。