miR-21对骨质疏松小鼠骨髓基质细胞增殖的影响

李雷 王峰 刘念 张长城 李刚 宋晓飞 刘瑜 王华磊 赵玉果 杨国志

南阳市中心医院骨二科，河南 南阳 473000

骨质疏松症是一种全身骨代谢疾病，绝经后妇女骨折发生与骨质疏松有关，单位体积骨量减少、骨组织微环境发生退化是其主要特征[1]。骨质疏松症骨折不仅愈合缓慢而且愈合质量较差，畸形愈合风险较高。微小RNA(micro RNA，miRNA)是源于内源性转录物的单链非编码RNA[2]，生物信息学分析发现37个miRNA与绝经后骨质疏松症的某些核心疾病存在靶向作用[3]。骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells，BMSCs)是人体骨髓中具有分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等细胞潜能的多能干细胞[4]，其增殖能力降低会诱导骨质疏松症，雌性激素缺乏会引起BMSCs生物学特性改变，加重机体骨质疏松症进程，但其中具体作用机制尚未完全阐明[5]。miR-21纳米微局部注射可以促进骨折愈合生物活性[6]，但在绝经后妇女骨质疏松性骨折有关研究报道较少。本研究旨在探讨miR-21对绝经后骨质疏松症小鼠BMSCs增值能力与成骨能力的影响。

1 材料和方法

1.1 材料、骨质疏松症小鼠模型构建

将12只8周龄C57BL/6J雌性小鼠{南方医科大学[SCXK(粤)2016-0041}参考文献[7]进行双侧卵巢切除术(记为OVX组)，另选12只小鼠只切除卵巢周围接近的脂肪组织、不摘除卵巢(记为Ctrl组)，剩余操作与OVX组一致，术后腹腔注射4×104U青霉素预防感染。所有小鼠均在SPF级动物饲养房(温度22 ℃～24 ℃，湿度58%～57%，人工关照12 h/d)中连续饲养8周，Micro-CT扫描结果明确骨质疏松症小鼠模型构建成功。

1.2 BMSCs分离、培养及纯化

模型构建成功后，处死小鼠，α-MEM培养液(含10%血清)冲洗股骨、胫骨髓腔，移液器轻柔吹打均匀，800 r/min 5 min，弃上清，α-MEM培养液(含10%血清)重悬细胞，置于培养瓶在37 ℃、5% CO2加湿培养箱培养，细胞生长至培养瓶壁80%～90%，0.25%胰蛋白酶消化，制成细胞悬液，再次传代培养，取第3代细胞于后续实验。

1.3 主要试剂和仪器

MTT Assay Kit(YB111105-500，Ybscience)，siPORT NeoFX 转染剂(AM4510，美国Ambion公司)，α-MEM培养基(MEL07-6X500 ML，美国Caisson公司)，ant-miR-21和ant-miR-21 negative control、pre-miR-21和pre-miR-negative control(广州锐博生物科技有限公司)，PCNA、Ki67、Runx2抗体(FNab06217、FNab09788、FNab07536，武汉菲恩生物科技有限公司)，Osterix抗体(bs-1110R-1，上海恒斐生物科技有限公司)，茜素红(I0013，上海宝曼生物科技有限公司)，碱性磷酸酶染色试剂盒(XY-44274-1，上海信裕生物科技有限公司)，碱性磷酸酶活性试剂盒(CK-E20105，武汉益普生物科技有限公司)，miRNA提取试剂盒(ZYB1803，上海泽叶生物科技有限公司)，miRcute 增强型miRNA cDNA 第一链合成试剂盒、miRcute miRNA荧光定量检测试剂盒(SYBR Green)(KR211、FP411，天根生化科技有限公司)。

CO2细胞培养箱(Forma 3110，Thermo Fisher Scientific)，多功能酶标仪(SpectraMax iD3，美国Molecular Devices)，Micro-CT(80989787 日本hitachi-aloka)，7500 fast定量PCR仪器(100019，美国ABI公司)。

1.4 RT-PCR检测

提取Ctrl组、OVX组BMSCs的miRNA，反转录合成cDNA并作为PCR扩增模板，95 ℃ 15 min、94 ℃ 20 s，60 ℃，34 s，42个循环，U6为内参基因，2-ΔΔCt法计算基因相对表达量。重复3次。

1.5 miR-21转染小鼠BMSCs

Ctrl组BMSCs分为2组，OVX组BMSCs分为4组，参考文献[8]用siPORT NeoFX转染pre-miR-negative control(pre-miR-NC)、ant-miR-negative control(ant-miR-NC)至Ctrl组BMSCs，记为Ctrl-pre-miR-NC、Ctrl-ant-miR-NC；将pre-miR-21、pre-miR-NC、ant-miR-21、ant-miR-NC至OVX组BMSCs分别记为OVX-pre-miR-21、OVX-pre-miR-NC、OVX-ant-miR-21、OVX-ant-miR-NC，培养条件同1.2，培养48 h，进行miR-21相对表达水平RT-PCR验证。

1.6 MTT法检测细胞增殖情况

取1.5中转染所得BMSCs，调整细胞密度为2×104/mL，接种96孔板(100 μL/孔)，每组设置3个复孔，培养至24、48、72 h时，加入0.5 mg/mL MTT(100 μL/孔)，继续培养4 h，弃上清液，加入DMSO(200 μL/孔)孵育0.5 h，多功能酶标仪波长570 nm检测吸光值(A值)。重复3次。

1.7 BMSCs成骨诱导与茜素红染色

取1.5中转染所得BMSCs，生长融合达>70%时，培养液更换为成骨诱导液，诱导2周，茜素红染色[9]、碱性磷酸酶(ALP)染色法[10]、ELISA法检测BMSCs成骨能力和ALP活性。茜素红染色：诱导结束后，弃成骨诱导液，4%多聚甲醛固定0.5 h，茜素红染色0.5 h，PBS洗涤10 min，显微镜观察；茜素红染色定量：茜素红染色后，加入CPC溶液，充分溶解，波长562 nm检测光度值，茜素红染色相对定量=实验组光度值/对照组光度值。ALP染色：细胞固定同茜素红染色，加400 μL ALP染液，室温避光染色1 h，清水冲洗2次，晾干，显微镜观察。ALP活性按照ELISA法试剂盒说明书操作。

1.8 Western-blotting检测

提取1.5中BMSCs培养48 h细胞总蛋白，调整蛋白浓度、SDS-PAGE凝胶电泳、转PVDF膜、密封2 h，加入PCNA、Ki67、Runx2、Osterix、β-actin一抗(1∶500)4 ℃孵育过夜，加入HRP标记二抗(1∶500)孵育1 h，显色，凝胶成像系统自带软件分析条带灰度相对值。重复3次。

1.9 统计学分析

使用GraphPad Prism、SPSS 22.0软件，数据以均值±标准差表示，多组间用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验；两组比较采用t检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 骨质疏松小鼠BMSCs中miR-21表达水平

VOX组骨质疏松小鼠BMSCs中miR-21表达水平低于Ctrl组(P<0.05)(图1)。

图1 骨质疏松小鼠BMSCs中miR-21表达水平Fig.1 Expression level of miR-21 in BMSCs of osteoporosis mice注：与Ctrl组比较，*P<0.05。

2.2 miR-21转染骨质疏松小鼠BMSCs验证

OVX-pre-miR-21组BMSCs中miR-21相对表达水平高于OVX-pre-miR-NC组(P<0.05)，OVX-pre-miR-NC组BMSCs中miR-21相对表达水平低于Ctrl-pre-miR-NC组(P<0.05)；OVX-ant-miR-21组BMSCs中miR-21相对表达水平低于OVX-ant-miR-NC组(P<0.05)，OVX-ant-miR-NC组BMSCs中miR-21相对表达水平低于Ctrl-ant-miR-NC(P<0.05)(图2)。

图2 miR-21转染骨质疏松小鼠BMSCs验证A：miR-21高表达验证，与Ctrl-pre-miR-NC组比较，*P<0.05；与OVX-pre-miR-NC组比较，#P<0.05；B：miR-21低表达验证，与Ctrl-ant-miR-NC组比较，*P<0.05；与OVX-ant-miR-NC组比较，#P<0.05Fig.2 Verification of BMSCs transfected with miR-21 in osteoporosis miceA: Verification of high expression of miR-21, compared with Ctrl-pre-Mir-NC group, *P<0.05; Compared with OVX-pre-Mir-NC group, #P<0.05; B: Verification of low expression of miR-21, *P<0.05 compared with Ctrl-ant-Mir-NC group; Compared with OVX-ant-Mir-NC group, #P<0.05

2.3 miR-21对骨质疏松小鼠BMSCs增殖的影响

OVX-pre-miR-21组细胞增殖、PCNA、Ki67水平高于OVX-pre-miR-NC组与Ctrl-pre-miR-NC(P<0.05)，OVX-pre-miR-NC组细胞增殖、PCNA、Ki67水平低于Ctrl-pre-miR-NC(P<0.05)；OVX-ant-miR-21组细胞增殖、PCNA、Ki67水平低于OVX-ant-miR-NC组与Ctrl-ant-miR-NC(P<0.05)，OVX-ant-miR-NC组细胞增殖、PCNA、Ki67水平低于Ctrl-ant-miR-NC(P<0.05)(图3)。

图3 miR-21对骨质疏松小鼠BMSCs增殖的影响A：miR-21高表达下BMSCs细胞增殖情况(24、48、72 h)；B：miR-21低表达BMSCs细胞增殖情况(24、48、72 h)；C：miR-21高表达下BMSCs(48 h)PCNA、Ki-67凝胶成像结果；D：miR-21低表达下小鼠BMSCs(48 h)PCNA、Ki-67凝胶成像结果；E：C图蛋白水平统计结果；与Ctrl-pre-miR-NC组比较，*P<0.05，与OVX-pre-miR-NC组比较，#P<0.05；F：D图蛋白水平统计结果；与Ctrl-ant-miR-NC组比较，*P<0.05；与OVX-ant-miR-NC组比较，#P<0.05Fig.3 The effect of miR-21 on the proliferation of BMSCs in osteoporosis miceA: Proliferation of BMSCs cells under high expression of miR-21 (24, 48, 72 h); B: Proliferation of BMSCs with low expression of miR-21 (24, 48 and 72 h); C: The imaging results of BMSCs (48 h) of PCNA and Ki-67 gel with highly expressed miR-21. D: The imaging results of BMSCs (48 h) of PCNA and Ki-67 gel with lowly expressed miR-21. E: Figure C statistical results of protein levels; Compared with Ctrl-pre-Mir-NC group, *P<0.05, compared with OVX-pre-Mir-NC group, #P<0.05; F: Fig. D statistical results of protein level; Compared with Ctrl-ant-Mir-NC group, *P<0.05; Compared with OVX-ant-Mir-NC group, #P<0.05

2.4 miR-21对骨质疏松小鼠BMSCs成骨能力的影响

OVX-pre-miR-21组ALP染色程度和活性、茜素红染色程度、Runx2、Osterix水平高于OVX-pre-miR-NC组(P<0.05)，OVX-pre-miR-NC组ALP染色程度和活性、茜素红染色程度、Runx2、Osterix水平低于Ctrl-pre-miR-NC组(P<0.05)；OVX-ant-miR-21组ALP染色程度和活性、茜素红染色程度、Runx2、Osterix水平低于OVX-ant-miR-NC组与Ctrl-ant-miR-NC(P<0.05)，OVX-ant-miR-NC组ALP染色程度和活性、茜素红染色程度、Runx2、Osterix水平低于Ctrl-ant-miR-NC(P<0.05)(图4～6)。

图4 各组骨质疏松小鼠BMSCs ALP染色结果A：各组骨质疏松小鼠BMSCs ALP染色(×200)，a：Ctrl-pre-miR-NC组，b：OVX-pre-miR-NC组，c：OVX- pre-miR-21组，d：Ctrl-ant-miR-NC组，e：OVX-ant-miR-NC组，f：OVX-ant-miR-21组；B：miR-21高表达下BMSCs ALP活性，与Ctrl-pre-miR-NC组比较，*P<0.05；与OVX-pre-miR-NC组比较，#P<0.05；C：miR-21低表达下BMSCs ALP活性，与Ctrl-ant-miR-NC组比较，*P<0.05；与OVX-ant-miR-NC组比较，#P<0.05Fig.4 ALP staining results of BMSCs in each groupA: BMSCs and ALP staining of osteoporosis mice in each group(×200), a: Ctrl-pre-Mir-NC group, B: OVX-pre-Mir-NC group, C: OVX-pre-miR-21 group, D: Ctrl-ant-Mir-NC group, e: OVX-ant-Mir-NC group, F: OVX-ant-miR-21 group; B: ALP activity of BMSCs under high expression of miR-21, *P<0.05 compared with Ctrl-pre-Mir-NC group; Compared with OVX-pre-Mir-NC group, #P<0.05; C: ALP activity of BMSCs under low expression of miR-21, compared with Ctrl-ant-Mir-NC group, *P<0.05; Compared with OVX-ant-Mir-NC group, #P<0.05

3 讨论

骨质疏松症是指因骨量减低与骨组织的微结构发生变化引起的骨骼强度下降、脆性增强疾病，女性绝经后，雌性激素缺乏可加速骨吸收，导致骨组织微结构发生改变。BMSCs在特定的条件下可以分化为成骨细胞、软骨细胞以及脂肪细胞等，BMSCs分化成骨细胞分化受多种因素影响。miR-141-3p可靶向抑制基质细胞衍生因子-1(SDF-1)表达抑制小鼠BMSCs成骨转化[11]。miR-21在雌性激素缺乏状态下可以促进小鼠BMSCs成骨分化[12]，本研究发现骨质疏松小鼠BMSCs miR-21表达水平降低，miR-21高表达可以提高BMSCs细胞增殖、PCNA、Ki67水平，miR-21低表达呈反向趋势。PCNA是可促进DNA延伸与合成的核蛋白，对激活细胞增殖具有重要意义。Ki67是与细胞增殖相关的细胞核抗原， 可调节细胞的有丝分裂，说明miR-21高表达可以增强骨质疏松症小鼠BMSCs细胞增殖能力。

图5 各组骨质疏松小鼠BMSCs茜素红染色结果A：各组骨质疏松小鼠BMSCs 茜素红染色(×200)，a：Ctrl-pre-miR-NC组，b：OVX-pre-miR-NC组，c：OVX- pre-miR-21组，d：Ctrl-ant-miR-NC组，e：OVX-ant-miR-NC组，f：OVX-ant-miR-21组；B：miR-21高表达下茜素红相对定量，与Ctrl-pre-miR-NC组比较，*P<0.05；与OVX-pre-miR-NC组比较，#P<0.05；C：miR-21低表达下茜素红相对定量，与Ctrl-ant-miR-NC组比较，*P<0.05；与OVX-ant-miR-NC组比较，#P<0.05Fig.5 Alizarin red staining results of BMSCs in each groupA: Alizarin red staining of BMSCs of osteoporosis mice in each group(× 200), a: Ctrl-pre-Mir-NC group, B: OVX-pre-Mir-NC group, C: OVX-pre-miR-21 group, D: Ctrl-ant-Mir-NC group, e: OVX-ant-Mir-NC group, F: OVX-ant-miR-21 group; B: The relative quantification of Alizarin red under high expression of miR-21. Compared with Ctrl-pre-Mir-NC group, *P<0.05; Compared with OVX-pre-Mir-NC group, #P<0.05; C: The relative quantification of Alizarin red under low expression of miR-21, compared with Ctrl-ant-Mir-NC group, *P<0.05; Compared with OVX-ant-Mir-NC group, #P<0.05

图6 各组骨质疏松小鼠BMSCs Runx2、Osterix水平A：miR-21高表达下BMSCs(48 h)Runx2、Osterix凝胶成像结果；B：miR-21低表达下BMSCs(48 h)Runx2、Osterix凝胶成像结果；C：A图蛋白水平统计结果，与Ctrl-pre-miR-NC组比较，*P<0.05；与OVX-pre-miR-NC组比较，#P<0.05；D：B图蛋白水平统计结果；与Ctrl-ant-miR-NC组比较，*P<0.05；与OVX-ant-miR-NC组比较，#P<0.05Fig.6 Runx2 and Osterix levels of BMSCs in each groupA：Imaging results of BMSCs (48 h) Runx2 and Osterix gel under high expression of miR-21；B：Imaging results of BMSCs (48 h) Runx2 and Osterix gel under low expression of miR-21；C：Figure A statistical results of protein level, compared with Ctrl-pre-Mir-NC group, *P<0.05; Compared with OVX-pre-Mir-NC group, #P<0.05；D：Figure B statistical results of protein level; Compared with Ctrl-ant-Mir-NC group, *P<0.05; Compared with OVX-ant-Mir-NC group, #P<0.05

miR-21缺乏会降低骨形成速率，延长骨形成时间，可通过影响细胞增殖与迁移能力来调节骨吸收与破骨细胞生成能力。本研究发现miR-21高表达可以提高BMSCs细胞ALP染色程度、ALP活性、茜素红染色程度、Runx2、Osterix水平，miR-21低表达呈反向趋势。Runx2是早期成骨细胞分化的骨质基因表达启动子，其表达降低可抑制成骨形成[13]。Osterix是成骨分化的重要的含锌指结构的转录因子，位于Runx2下游，参与成骨细胞分化途径调控过程。miR-21可通过上调PI3K/Akt信号途径促进BMSCs迁移，miR-21表达水平升高可促进大鼠BMSCs增殖、侵袭及分化并修复心脏损伤[14]，但也有研究[15]认为miR-21可促进猪外周血干细胞成脂分化。本研究结果与前人部分研究结果相似，认为miR-21表达水平升高可以促进骨质疏松小鼠BMSCs增殖、成骨分化，与某些研究结果一致，可能与物种种类或BMSCs提取部位有关。

综上所述，miR-21表达水平升高可促进骨质疏松小鼠BMSCs增殖、成骨分化能力，可能与调节PCNA、Ki67、Runx2、Osterix水平有关，但其中具体作用机制还需要深入研究。