miR-135b靶向GSK3B抑制地塞米松诱导成骨细胞凋亡

肖建生 张鹏 赵洪洲 钟俊青

1.天津医科大学研究生院，天津 300070 2.天津医院骨科，天津 361000

地塞米松(dexamethasone，Dex)是一种人工合成的糖皮质激素，具有很强的抗炎和免疫抑制作用，是治疗发炎和自身免疫性疾病的常用药物[1]，与其他糖皮质激素一样，地塞米松对成骨细胞具有毒性作用，如低钙饲料加上1 mg/kg地塞米松每3 d一次持续6周即足有构建骨质疏松的大鼠模型[2]。探索地塞米松诱导成骨细胞损伤的机制并制定干预策略是目前的研究重点[3]。糖原合成酶激酶3B(glycogen synthase kinase 3B，GSK3B)是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，参与了细胞增殖、分化、存活和凋亡的调控[4]，是成骨细胞凋亡的重要调控蛋白[5]。miR-135b是一种参与了地塞米松诱导成骨细胞凋亡的小分子非编码RNA，然而miR-135b对成骨细胞凋亡的调控是否与GSK3B有关还未见报道[6]。本研究探索miR-135b在地塞米松诱导的细胞凋亡中可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

地塞米松从美国Sigma公司购得，DMEM培养基从美国Hyclone公司购得，RIPA试剂、Trizol试剂、BCA蛋白定量试剂盒、CCK8细胞活力检测试剂盒、Annexin V-FITC细胞凋亡试剂盒从上海碧云天生物技术有限公司购得，双荧光素酶报告检测试剂盒从美国Promega公司购得，反转录试剂盒SYBR Premix EX Taq Ⅱ从日本Takara公司购得，GSK3B一抗从英国Abcam公司购得，Bax、Bcl-2、caspase-3、caspase-9一抗及二抗从美国Santa Cruz公司购得，β-actin抗体从美国Bosterbio公司购得，实验所用引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.2 细胞实验

MC3T3-E1细胞培养于含10%胎牛血清，100 U/mL青霉素与100 μg/mL链霉素的DMEM培养基中，孵育箱温度37 ℃，CO2体积分数为5%，每2 d更换一次完全培养基。对于CCK-8，细胞经过浓度梯度的地塞米松处理24 h，加入10 μL CCK8试剂反应4 h，酶标仪检测450 nm吸光值。细胞分为对照组(Control)、地塞米松组(Dex)、阴性对照mimics组(mimics NC)、miR-135b组、miR-135b+pc-GSK3B组，按说明根据分组加药和转染，24 h后收集细胞用于后续实验。

1.3 动物实验

SD雄性SPF大鼠30只，体质量(200±20)g，由本院实验动物中心提供，饲养于通风良好，恒温恒湿的笼具中，笼具、垫料、食物和水均经过灭菌处理，大鼠适应性饲养1周，期间水和食料自由获取。随机数字表法随机分为对照组(Control)、模型组(Model)、miR-135b组，每组10只。模型组臀肌注射10 mg/kg地塞米松注射液，每周1次；miR-135b组除注射地塞米松注射液以外，还通过尾静脉注射给予miR-135b antagomir，每周一次；对照组注射等量生理盐水，持续8周。处死大鼠取双侧股骨头，通过X射线骨密度仪检测股骨头密度。对于HE染色，多聚甲醛固定后按常规方法染色和观察。

1.4 流式细胞术检测细胞凋亡

使用Annexin V-FITC结合液悬浮细胞后，根据试剂盒提供的操作说明，加入Annexin V-FITC试剂和PI，使用流式细胞仪对细胞凋亡进行检测。

1.5 RT-qPCR

使用Trizol试剂提取细胞或组织总RNA，反转录获取cDNA，通过SYBR Premix EX Taq Ⅱ试剂盒PCR检测基因表达，扩增条件按如下程序设置：95 ℃ 2 min，之后95 ℃ 5 s，60 ℃ 10 s 40个循环，2-ΔΔCt法进行计算基因表达水平。

1.6 蛋白印迹检测蛋白表达

蛋白用RIPA裂解液提取，BCA液校准，10% SDS-PAGE电泳分离，半干转法转移至PVDF膜，并通过5%牛血清白蛋白进行封闭处理2 h，弃去液体，加入适量一抗于4 ℃孵育，次日通过TBST缓冲液浸洗膜，弃去液体后二抗孵育2 h，ECL显色液显影。通过凝胶成像仪对各条带进行灰度分析。

1.7 双荧光素酶报告基因检测

构建GSK3B 3’-UTR pGL3 luciferase promoter野生型(WT)和突变型载体(MUT)，将载体同mimics NC或miR-135b mimics共转染细胞，24 h后通过双荧光素酶报告系统检测荧光素酶活性。

1.8 统计学分析

数据采用Graphpad prism 5进行统计分析，计量资料采用均数±标准差表示，两组比较采用t检验，多组比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用Tukey检验，P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 地塞米松对MC3T3-E1细胞活力的影响

研究发现地塞米松浓度高于50 μmol/L时，MC3T3-E1细胞活力抑制明显(P<0.05)，IC50约为500 μmol/L，因此后续实验采用200 μmol/L作为实验浓度。见图1。

图1 CCK8检测地塞米松对成骨细胞MC3T3-E1细胞活力的抑制作用Fig.1 Viability of MC3T3-E1 cells treated with dexamethasone注：n=3，与0 μmol/L组比较，*P<0.05，**P<0.01。

2.2 地塞米松对MC3T3-E1细胞凋亡以及miR-135b和GSK3B表达的影响

与Control组比较，Dex组MC3T3-E1细胞凋亡率增加(P<0.01)，见图2A；miR-135b表达水平降低(P<0.01)，见图2B；GSK3B mRNA表达水平升高(P<0.01)，见图2C。

图2 地塞米松对MC3T3-E1细胞凋亡以及miR-135b和GSK3B表达的影响A：流式细胞术检测细胞凋亡；B：RT-qPCR检测miR-135b表达；C：RT-qPCR检测GSK3B mRNA表达Fig.2 Apoptosis, and levels of miR-135b and GSK3B of MC3T3-E1 cells treated with dexamethasone. (A) Apoptosis tested with flow cytometry. RNA levels of miR-135b (B) and GSK3B (C) were tested with RT-qPCR.注：n=6，与Control组比较，**P<0.01。

2.3 miR-135b与GSK3B靶向作用关系

如图3A所示，通过Targetscan数据库预测miR-135b和GSK3B存在靶向作用关系。如图3B所示，与GSK3B WT+mimics NC组比较，GSK3B WT+miR-135b组细胞中荧光素酶活性降低(P<0.01)，而GSK3B MUT+mimics NC组和GSK3B MUT+miR-135b组比较，细胞荧光素酶活性无显著差异。

图3 miR-135b与GSK3B靶向作用关系A：miR-135b和GSK3B靶向序列的Targetscan预测；B：荧光素酶报告实验检测miR-135b和GSK3B靶向作用Fig.3 Targeting of GSK3B with miR-135b. (A) The targeting relationship predicted with Targetscan. RNA levels of miR-135b (B) Targeting of GSK3B with miR-135b validated with luciferase reporter assay.注：n=6，与GSK3B WT+mimics NC组比较，**P<0.01。

2.4 miR-135b对地塞米松诱导GSK3B蛋白表达的影响

与Control组比较，Dex组MC3T3-E1细胞miR-135b表达水平降低(P<0.01)，miR-135b组miR-135b表达水平升高(P<0.01)，见图4A；与Control组比较，Dex组GSK3B蛋白水平升高(P<0.01)，与Dex组比较， miR-135b组GSK3B蛋白水平降低(P<0.01)，与miR-135b组比较，miR-135b+pc-GSK3B组GSK3B蛋白水平升高(P<0.01)，见图4B。

图4 转染miR-135b对MC3T3-E1细胞GSK3B蛋白表达的影响A：RT-qPCR检测miR-135b转染效率；B：蛋白印迹检测GSK3B蛋白表达Fig.4 MC3T3-E1 cell expression of GSK3B protein when transfected with miR-135b. (A) Transfection validated with RT-qPCR. (B) GSK3B expression tested with western blotting.注：n=6，与Control组比较，**P<0.01；与Dex组比较，##P<0.01；与miR-135b组比较，&&P<0.01。

2.5 miR-135b对地塞米松诱导MC3T3-E1细胞凋亡的影响

与Control组比较，Dex组MC3T3-E1细胞凋亡率升高(P<0.01)；与Dex比较，miR-135b组MC3T3-E1细胞凋亡率降低(P<0.01)；与miR-135b组比较，miR-135b+pc-GSK3B组MC3T3-E1细胞凋亡率升高(P<0.01)。见图5。

图5 miR-135b对地塞米松诱导MC3T3-E1细胞凋亡的影响A：流式细胞术检测凋亡；B：细胞凋亡率Fig.5 Apoptosis of dexamethasone (Dex) challenged MC3T3-E1 cells treated with miR-135b. (A) apoptosis tested with flow cytometry. (B) Apoptotic cell rates.注：n=6，与Control组比较，**P<0.01；与Dex组比较，##P<0.01；与miR-135b组比较，&&P<0.01。

2.6 miR-135b对地塞米松诱导MC3T3-E1细胞Bax和Bcl-2水平影响

与Control组比较，Dex组MC3T3-E1细胞Bax蛋白水平升高(P<0.01)，Bcl-2蛋白水平降低(P<0.01)；与Dex组比较，miR-135b组Bax蛋白水平降低(P<0.01)，Bcl-2蛋白水平升高(P<0.01)；与miR-135b组比较，miR-135b+pc-GSK3B组Bax蛋白水平升高(P<0.01)，Bcl-2蛋白水平降低(P<0.01)。见图6。

图6 蛋白印迹检测Bax和Bcl-2蛋白表达Fig.6 Bax and Bcl-2 expression tested with Western blotting注：n=6，与Control组比较，**P<0.01；与Dex组比较，##P<0.01；与miR-135b组比较，&&P<0.01。

2.7 miR-135b对地塞米松诱导MC3T3-E1细胞cleaved caspase-3和cleaved caspase-9水平的影响

与Control组比较，Dex组MC3T3-E1细胞中cleaved caspase-3与cleaved caspase-9蛋白水平升高(P<0.01)；与Dex组比较，miR-135b组中cleaved caspase-3与cleaved caspase-9蛋白水平降低(P<0.01)；与miR-135b组比较，miR-135b+pc-GSK3B组中cleaved caspase-3与cleaved caspase-9蛋白水平升高(P<0.01)。见图7。

图7 蛋白印迹检测CASP3和CASP9蛋白活化Fig.7 CASP3 and CASP9 expression tested with Western blotting注：n=6，与Control组比较，**P<0.01；与Dex组比较，##P<0.01；与miR-135b组比较，&&P<0.01。

2.8 miR-135b降低模型大鼠股骨头组织中GSK3B蛋白表达

与Control组比较，Model组大鼠股骨头组织中miR-135b表达水平降低(P<0.01)，同时GSK3B蛋白水平升高(P<0.01)；与Model组比较，miR-135b组大鼠股骨头组织中miR-135b表达水平升高(P<0.01)，同时GSK3B蛋白水平降低(P<0.01)。见图8。

图8 转染miR-135b对股骨头组织GSK3B表达的影响Fig.8 Expression of GSK3B in the femoral head transfected with miR-135b注：n=10，与Control组比较，**P<0.01；与Model组比较，##P<0.01。

2.9 miR-135b恢复模型大鼠股骨头骨密度

与Control组比较，Model组大鼠股骨头骨密度降低(P<0.01)，经过miR-135b作用后，与Model组比较，miR-135b组大鼠股骨头骨密度升高(P<0.01)。见图9。

图9 miR-135b对股骨头骨密度的影响Fig.9 Effect of miR-135b on bone mineral density of the femoral head注：n=10，与Control组比较，**P<0.01；与Model组比较，##P<0.01。

2.10 miR-135b减轻股骨头组织病变

对照组大鼠骨小梁结构完好；模型组可观察到骨小梁纤细，排列紊乱，空骨陷窝增多，骨细胞萎缩，并出现脂肪滴和嗜酸性粒细胞的聚集；miR-135b组虽然也出现了上述病变，但程度明显减轻。见图10。

图10 miR-135b对股骨头组织病变的影响(×200)Fig.10 Effect of miR-135b on pathological changes of the femoral head (200×).

3 讨论

糖皮质激素常被用于炎症或自身免疫疾病的治疗中[7-8]。过量的糖皮质激素常常会抑制成骨细胞增殖，诱导其凋亡，并最终导致非创伤性骨坏死[9]。地塞米松诱导成骨细胞凋亡的能力与GSK3B有关[5,10]。Fan等[6]研究表明，miR-135b具有保护成骨细胞免受地塞米松诱导损伤的功能，尽管Xiao等[11]在胶质细胞瘤的研究中发现miR-135b与GSK3B可能存在靶向作用关系，然而miR-135b对成骨细胞的保护作用是否与靶向作用于GSK3B还未见报道。本研发现经过地塞米松处理后，MC3T3-E1细胞凋亡水平增加，与此同时细胞中miR-135b表达水平下调而GSK3B表达水平上调，这一结果表明地塞米松诱导成骨细胞凋亡与miR-135b和GSK3B的表达可能存在联系。进一步通过荧光素酶报告实验，验证miR-135b可靶向作用于GSK3B。

GSK3B激活与成骨细胞的凋亡有着紧密联系，糖皮质激素可通过激活GSK3B诱导成骨细胞凋亡，siRNA敲低GSK3B表达可降低Bax和caspase-3表达并增加Bcl-2表达[12]，这类过程最终抑制细胞凋亡[13-14]。为了进一步探究miR-135b和GSK3B对地塞米松诱导成骨细胞凋亡的调控作用及其相关机制，本研究通过转染miR-135b mimics和GSK3B过表达载体对地塞米松诱导的MC3T3-E1进行干预，发现miR-135b水平升高可减少细胞凋亡率，同时抑制GSK3B、Bax、cleaved caspase-3和cleaved caspase-9蛋白水平，并升高Bcl-2蛋白水平，而GSK3B过表达可扭转miR-135b水平升高引起的上述变化。

综上，本研究证实了miR-135b可通过靶向抑制GSK3B，抑制地塞米松诱导的成骨细胞凋亡。