基于生物信息学分析骨质疏松症与阿尔茨海默症的相互关系

刘树华 陈桐莹 赵宇 王世浩 王若琳 张桂鑫 黄宏兴 万雷*

1.广州中医药大学第三临床医学院，广东 广州 510405 2.广州中医药大学第六临床医学院，广东 深圳 518034 3.广州中医药大学第三附属医院，广东 广州 510375

骨质疏松症(osteoporosis，OP)是中老年人常见的疾病，主要特点是骨量丢失加重、骨微结构遭到破坏，进而导致骨脆性和骨折风险增加[1]。骨质疏松症和骨质疏松性骨折的治疗和护理不论对于家庭还是社会都会带来沉重的负担。2015年的一项预测显示[2]，2035年我国骨质疏松性骨折的医疗费用将会达到199.2亿美元，而到2050年将会达到254.3亿美元。阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一种神经系统退行性疾病，其特点为起病隐匿并且进行性发展，病因迄今未明。据预测，到2050年，AD患者将增长到1.35亿，约每33 s就会出现一例AD[3-4]。阿尔茨海默症的治疗和护理同样伴随着沉重的负担。

OP和AD看似两种发生在不同系统的相互独立的疾病，但是两者都是老年人常见的疾病，同时AD与OP有着共同的影响因素：年龄、睡眠质量、吸烟、酗酒、生活经济地位、雌激素水平、运动、体质量指数[5-6]。

关于OP与AD的关系，有研究认为AD是OP的危险因素[7]。AD患者面临骨密度低水平及髋部骨折的风险提高近两倍[8]，由于AD患者昼夜节律改变，他们活动时间更多集中在晚上，而白天昏昏欲睡，并且这些症状随着认知功能不断恶化更加明显，这将导致他们缺乏适当的户外体育锻炼和阳关照射，诱发或加重OP[8-9]。

另有学者认为OP与AD存在共同致病因素并促进两病的发展。AD的一个病理特点是大量β淀粉样蛋白(Amyloid β-protein，Aβ)在大脑神经细胞外沉积形成老年斑。有研究发现，Aβ在骨质疏松性骨组织中水平升高，且Aβ的表达水平与骨密度水平呈负相关[7,10]。除此之外，载脂蛋白4(APOE4)是一种主要的胆固醇载体，能够与Aβ结合而促进Aβ的沉积，是公认的阿尔茨海默病的遗传风险因素[11]，APOE4基因也被发现与骨质疏松症有关，其中具有APOE 4等位基因的女性患髋部骨折的可能性是没有APOE 4等位基因的女性的两倍[12]。关于Aβ和APOE4基因在AD与OP中的确切关系仍需要强有力的证据。这提示可以分析两病中特异性较高的交集基因探索OP和AD的关系。

MiRNA是短的非编码核糖核苷酸，长度为19～25个核苷酸，其作用是通过抑制翻译或使mRNA降解来调节基因的表达[13]。目前研究OP与AD的关系很少深入到非编码RNA方面，通过结合miRNA和生物信息学研究OP与AD关系的报道更为稀缺。

本研究通过对基因芯片GSE147232、GSE93883分别进行生物信息学分析并筛选两基因芯片DEmiRNAs，分别预测与这些DEmiRNAs的靶向基因，为阐明OP与AD的关系以及相关治疗药物的研发提供依据。

1 材料和方法

1.1 收集数据

从GEO公共数据库中查询OP与AD患者的基因芯片，下载OP基因芯片GSE93883，芯片包含12个骨质疏松症患者的样本和6个健康人的样本，在骨质疏松症患者的样本中有6例为骨质疏松症伴椎体骨折患者，另外6例为骨质疏松症无椎体骨折患者。本研究将骨质疏松不伴椎体骨折患者的样本和骨质疏松伴椎体骨折患者的样本分别与健康人样本做独立分析，其中筛选条件为P<0.05和∣logFC∣≥1，发现伴椎体骨折患者的DEmiRNAs与不伴椎体骨折患者的DEmiRNAs具有较大的差异，其中OP不伴椎体骨折患者的DEmiRNAs有268个、OP伴椎体骨折患者的DEmiRNAs有270个，但是两者交集的miRNAs仅有133个。通过检索相关文献，有研究表明骨折后血清中miRNA会发生相应的改变，但无法确定这些miRNA是导致骨折的原因还是发生骨折后机体产生的其他改变[14]。为了避免椎体骨折后产生的误差，本研究将基因芯片中6例为骨质疏松症伴椎体骨折患者的样本舍去。下载AD基因表达芯片GSE147232，芯片包含6个正常老化的样本和6个阿尔茨海默症的样本。

1.2 差异表达的miRNA

使用GEO数据库自带的GEO2R在线分析(该工具能够对选定的组别进行分析，自动筛选出差异表达的基因)，筛选出两个基因芯片DEmiRNAs。对生成的数据进行统计学分析，以P<0.01和∣logFC∣≥1作为条件，再用Venny 2.1筛选出OP与AD相交集的DEmiRNAs。

1.3 预测DEmiRNAs的靶基因

目前用来预测miRNA靶基因的常用数据有TargetScan数据库[15]和miRDB数据库[16]。用以上两个数据库分别预测DEmiRNAs的靶基因，通过TargetScan数据中自带的Total context++ score(该分数绝对值越大，靶点可能性越大)，按绝对值高低筛选出前200个靶基因；同样通过miRDB数据中自带的Target Score，按分数高低筛选出前200个靶基因，再用Venny生成交集基因。

1.4 靶基因富集分析

对筛选后的靶基因进行Gene Ontology(GO)和KEGG 通路分析。GO即基因本体论，是分析基因的常用方法，能通过分析靶基因参与的生物过程(biological pocess，BP)、细胞组分(clular cmponent，CC)及分子功能(molecular function，MF)对靶基因进行分类与注释。KEGG 通路能分析基因在生物体内所参与的代谢过程。本研究使用DAVID数据库的在线分析工具对靶基因进行富集分析[17]。GO各项分析及KEGG 信号通路分析的筛选条件均为P<0.01 。

1.5 蛋白互作网络与模型的构建

Cytoscape是将网络数据可视化的一个软件。本研究将筛选出来的DEmiRNA与筛选出来的靶基因导入Cytoscape中制作miRNA-mRNA互作网络。STRING(search tool for the retrieval of interacting genes)为蛋白互作网络分析工具，能展示蛋白质与蛋白质间的相互关系[18]。

2 结果

2.1 DEmiRNAs的分析结果

GEO2R分析后得到10个DEmiRNAs，其中包含hsa-mirplus-c1110，因该miRNA序列目前仍为未知，并且是否存在仍未证实，故在本研究中舍去。DEmiRNAs的变化趋势与miRNA序列见表1。

表1 筛选后交集的DEmiRNAsTable 1 Differentially expressed miRNAs

2.2 制作miRNA-靶基因调控网络

通过上述条件筛选后，得到以下结果：hsa-miR-4321靶向15个基因，hsa-miR-196a-3p靶向56个基因，hsa-miR-5188靶向7个基因，hsa-miR-4638-5p靶向13个基因，hsa-miR-29b-3p靶向94个基因，hsa-miR-4756-3p靶向47个基因，hsa-miR-3200-3p靶向52个基因，hsa-let-7f-5p靶向13个基因，hsa-miR-550b-3p靶向67个基因。见图1。

图1 DEmiRNAs-mRNA调控网络Fig.1 DEmiRNAs-mRNA regulatory network注：菱形为miRNA，圆形为靶基因图形越大，颜色越深(红)，则Dgree分数越高。

2.3 GO各项与KEGG 通路的富集分析

富集分析结果显示靶基因在BP分析中主要集中在胶原分解代谢过程、细胞外基质的组成、胶原原纤维的组成等(表2)；在CC的分析中主要集中在胶原三聚体、内质网内腔、蛋白质细胞外基质、基底膜、V型胶原三聚体等(表3)；在MF的分析中集中在细胞外基质结构成分、血小板衍生生长因子结合等(表4)；在KEGG pathway的分析中主要集中在蛋白质消化吸收、局灶性粘连、ECM受体相互作用、PI3K-Akt等(表5)。

表2 差异靶基因的生物过程分析Table 2 Biological process analysis of differential target genes

表3 差异靶基因的细胞组分分析Table 3 Cell component analysis of differential target genes

表4 差异靶基因的分子功能分析Table 4 Molecular function analysis of differential target genes

表5 差异靶基因KEGG 通路分析Table 5 Analysis of KEGG pathway of differential target genes

2.4 PPI构建与核心基因的筛选

将靶基因导入STRING中进行分析并构建PPI网络(图2)，将PPI网络导入Cytoscape中，使用其自带的网络分析工具，得到各个基因的连接度(degree)。Degree排名前10的基因定义为核心基因，分别为COL1A1(degree=23)、VEGFA(degree=23)、COL4A1(degree=22)、COL3A1(degree=21)、COL5A1(degree=21)、COL2A1(degree=19)、 LOX(degree=18)、COL7A1(degree=18)、IGF1(degree=18)、COL5A2(degree=17)。使用Cytoscape中的MCODE分析PPI网络，得到10个集簇，包含45个节点和128条连线，并展示score 较高的4组集簇(图3)。

图2 靶基因的PPI网络Fig.2 The PPI network of target genes

图3 分数最高的4组集簇(A的分数为14分，B、C、D的分数为4分)Fig.3 Four sets of clusters with the highest score(A score=14; B, C, D score=4)

3 讨论

3.1 DEmiRNAs分析

本研究通过分析基因芯片GSE93883、GPL18058，得到OP与AD差异表达的miRNA，进而分析OP与AD之间的关系。数据显示，degree分数最高的10个核心基因均为hsa-miR-29b-3p的靶基因，这说明OP与AD之前的关系与hsa-miR-29b-3p有密切的关系，或许可以作为诊断和治疗两病的一个方向，值得深入研究。有研究表明miR-29b是骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)向成骨细胞分化过程中表达最为明显的miRNA之一。在BMSCs向成骨细胞分化过程中，miR-29b主要发挥着两方面功能。一方面，miR-29b作为成骨途径的调节剂，能促进成骨细胞分化，另一方面，miR-29b充当成熟成骨细胞中胶原合成的衰减剂，以维持分化的表型[19]。与此同时，β-位点淀粉样前体蛋白裂解酶1(Beta-site amyloid precursor protein cleaving enzyme-1，BACE1)能对APP蛋白连续水解和裂解，是导致Aβ肽积累的重要机制之一，被认为是抑制Aβ肽产生的主要药物靶点[20]。miR-29b被证实能够抑制神经细胞中BACE1蛋白的表达，进而抑制Aβ肽的产生[21]。因此miR-29可用于治疗AD，pre-miR-29b同样能起到治疗AD的作用而且更容易纯化[22]。

研究表明单独使用miRNA难以起到治疗效果，将miRNA放入外泌体中能避免miRNA被降解并能高效地发挥作用。外泌体是直径为30～120 nm的囊泡，包含多种生物活性分子，包括蛋白质、脂类、代谢产物、mRNA、非编码RNA[23-25]。用外泌体作为药物载体时，可以避免潜在的毒性和免疫原性，还能穿透目标特定器官[26]。因此由hsa-miR-29b-3p或pre-hsa-miR-29b包装而成的外泌体或许可以用于治疗同时患有OP与AD的患者。hsa-let-7f-5p与hsa-mir-550b-3p对OP与AD的关系缺乏相关文献报道，该miRNA在两病作用趋势相反的原因仍需深入研究。

3.2 靶基因分析

10个核心基因中有7个为胶原蛋白家族，大量研究已经证明胶原蛋白与骨代谢有重要的关系。构成骨的主要成分为矿物质和有机成分，有机成分中Ⅰ型胶原蛋白占90%，Ⅰ型胶原蛋白的含量与OP的发生密切相关[27]。除此之外，Ⅰ型胶原代谢产生的Ⅰ型前胶原氨基端原肽(PINP)、Ⅰ型前胶原羧基端原肽(PICP)、Ⅰ型胶原交联羧基端肽(CTXI)、Ⅰ型胶原交联氨基端肽(NTXI)，被广泛用于衡量骨代谢水平，对早期诊治OP有重要的意义[27]，但是胶原蛋白与AD的关系鲜有报道，因此胶原蛋白与AD的关系值得深入研究。

在10个核心基因中，Degree排名同为第一的还有VEGFA基因(degree=23)，VEGFA是血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)家族中的一员，研究表明VEGF是耦合血管生成和成骨所必需的[28]。VEGF存在多种分泌方式来调节成骨细胞的功能，在骨重建和骨修复中发挥着重要的作用[29]。VEGFA在AD的高危人群中同样具有保护作用。APOE4等位基因携带者是认知下降的高度易感人群，VEGF对APOE-4携带者具有独特的保护作用[30]。

GO富集分析有利于深入认识靶基因的作用和功能，GO各项数据表明，靶基因更多富集在胶原蛋白与细胞外基质的合成过程中，同时证实胶原蛋白与细胞外基质的合成在OP与AD关系中的重要性。KEGG通路富集分析显示与PI3K-Akt信号通路、mTOR信号通路有密切关系。相关研究表明，PI3K-Akt信号通路与AD有密切关系，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SODs)能够防止过量的活性氧形成过氧化氢，而PI3K/AKT途径已被证明在神经保护和通过增强SODs的表达抑制细胞凋亡方面起着关键作用。这种途径在阿尔茨海默病中至关重要，因为它能减少tau蛋白的过度磷酸化[31]。相关研究证实，阿尔茨海默症和轻度认知障碍受试者的下顶叶的PI3K/Akt/mTOR轴过度活跃[32]。

而对于OP，PI3K/AKT通路被证明能够调节细胞的增殖、分化与凋亡，并能够促进成骨细胞增殖和分化，达到抑制OP的效果[33]。mTOR是属于磷酸肌醇3激酶(phosphoinositide 3-kinase，PI3K)相关激酶家族中一员，mTOR与不同的蛋白结合，能形成功能不同的复合物，主要为mTOR复合物1(mTORC1)和mTOR复合物2(mTORC2)。研究证实mTORC1通过抑制NF-κb和NFATc1的相关通路来抑制破骨细胞分化，而这两个因子都是破骨细胞生成的关键转录因子[34]。

3.3 OP与AD的关系

综合各因素，包括：①OP与AD有许多共同的影响因素，其中年龄、睡眠质量、吸烟、酗酒、生活经济地位、雌激素水平、运动在两病的影响是相同的，仅体质量指数的影响是相反[5-6]；②9个DEmiRNAs中有7个miRNA的变化趋势呈正相关，只有2个miRNA为负相关，而且miR-29b-3p作为关键miRNA，靶向10个核心基因，其的变化关系在两病中为正相关；③通过查找相关文献和报道，预测的靶基因大部分对两病的作用趋势也是相同的。因此认为OP与AD存在正相关关系，胶原蛋白的缺乏或许是两疾病的共同病因，而由miR-29b-3p或pre-hsa-miR-29b包装而成的外泌体或许可以作为OP和AD新的治疗手段。