微生物多级发酵对中药方剂功能活性及有效组分的影响

张红艳， 冉淦侨， 韩姗姗， 殷 红， 谭建新， 张 强*

（1.陕西省生物农业研究所，陕西 西安710043；2.陕西省酶工程技术研究中心，陕西 西安710043；3.陕西乐丽鑫生物科技有限公司，陕西 渭南714005）

发酵作为一种重要的中药炮制方法，其目的是改变原有药性，产生新的治疗作用。发酵后的中药制剂具有去毒存效、增强药效、提高中药提取率等作用[1]。中药的有效成分主要存在于植物细胞中，被细胞壁等组织包裹在细胞内部，而微生物发酵产生的酶系可以将植物细胞壁降解，促使有效成分更易释放，从而起到增加药效的作用。

传统发酵炮制通常是利用环境中的野生微生物对药渣或药液进行自然发酵，存在条件简陋、易染杂菌、发酵质量难以保证等缺点[2]。

现代中药发酵技术是利用益生菌和酶特有的生物转化能力，使中草药的有效成分被充分提取，不仅能减毒增效，还能产生新的易被人体吸收的活性物质[3]。

国内许多研究者[4-9]对中药发酵进行了研究，结果表明中药发酵后粗蛋白质、粗脂肪、多糖以及总黄酮、总皂苷等都有不同程度的增加。潘杨等[10]研究表明发酵炮制可使中药巴豆的毒性降低。苏建树等[11]研究发现川乌、附子经黑曲霉发酵后，乌头碱、次乌头碱等毒性物质显著减少。以上大多数研究都是采用单一菌株进行发酵或者是固体发酵，对多菌株多级液体发酵中药的研究较少。

中药方剂JGZF是由药食同源组分配比煎熬而成。JGZF药液含有牛膝皂苷、蜕皮甾酮、齐墩果酸及其衍生物、地骨皮甲素、菟丝子糖苷酸、肉桂酸、柠檬酸、壬二酸、棕榈酸甲酯、杜仲木脂素、L-酪氨酸、精氨酸、金丝桃苷等天然活性成分，同时富含钙、铁、锌、镁等多种微量元素。作者采用3种方式（直接煎熬、自然发酵、人工发酵）对JGZF进行处理，对比不同处理方式下JGZF药液中微量元素、抗氧化活性、抑菌活性以及其他药效成分的变化，旨在考察不同的发酵炮制方法对JGZF方剂的功能活性及有效组分的影响，为今后发酵炮制技术在JGZF方剂中的工业化应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 中药方剂JGZF桂圆、杜仲、蒺藜、山药、菟丝子、枸杞、当归、怀牛膝、鱼鳔，按一定比例混合粉碎而成，由陕西乐丽鑫生物有限公司提供。

1.1.2 菌种产朊假丝酵母 （Candida utilisCICC31126）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiaeHansen GIM2.137）、 植 物 乳 杆 菌（Lactobacillus plantarumCICC20265）、副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracaseiCGMCC1.574）、 青 春 双 歧 杆 菌（Bifidobacterium adolensentisCICC6176）：由陕西省生物农业研究所保藏提供；高活性干酵母：安琪酵母股份有限公司产品。

1.1.3 培养基麦芽汁培养基 （g/L）：麦芽膏粉130，pH 6.4±0.1；强化羧菌培养基（g/L）：蛋白质10.0牛肉粉10.0，酵母粉3.0，葡萄糖5.0，可溶性淀粉1.0，氯化钠5.0，醋酸钠3.0，L-半胱氨酸盐酸盐0.5，pH 6.8±0.1（25℃）；MRS肉汁培养基（g/L）：蛋白质10.0，牛肉粉8.0，酵母粉4.0，葡萄糖20.0，磷酸氢二钾2.0，柠檬酸氢二铵2.0，乙酸钠5.0，硫酸镁0.2，硫酸锰0.04，吐温80 1.0，pH 5.7±0.2（25℃）。

1.2 实验设备

RE-201D旋转蒸发仪：上海秋佐科学仪器有限公司产品；FL-30流水式中药粉碎机：瑞安市富力中药机械厂产品。

1.3 实验方法

1.3.1 直接熬制取1kg中药按配方比例混合粉碎后，按质量比1∶2加入饮用水浸泡煎熬两次，滤网粗滤后用真空旋转蒸发仪（60℃）浓缩药液至1 L，离心 （10 000 r/min，20 min）后灭菌 （121℃，20 min），得到直接熬制的中药原液。

1.3.2 自然发酵取1 kg中药按配方比例混合粉碎后，按质量比1∶4加入饮用水浸泡1 h后用食醋调pH至4.8～5.0，加入复合酶粉（8 g/L），37℃酶解过夜，酶解后的中药按上述方法煎熬两次，滤网粗滤后用真空旋转蒸发仪（60℃）浓缩药液至1 L，离心（10 000 r/min，20 min）后灭菌（121℃，20 min），得到中药酶解原液。

将酶解后的药液倒入已灭菌的玻璃发酵罐中，室温下自然发酵5周。定期取样检测营养活性成分。

1.3.3 人工发酵取1 kg中药按配方比例混合粉碎后，按1.3.2制备中药酶解原液，按比例将产朊假丝酵母、酿酒酵母、面包酵母（质量比为2∶1∶1）接入到上述的酶解中药原液中，30℃好氧发酵7 d（有浓郁的酒香味道）。好氧发酵结束后，对发酵液进行灭菌（121℃，灭菌20 min），再按比例接入植物乳杆菌、副干酪乳杆菌、青春双歧杆菌（质量比为1∶1∶1），37℃，厌氧（静置）发酵7 d。厌氧发酵结束后，将中药发酵液按之前方法煎熬两次，两次煎熬的药液混合在一起，离心（10 000 r/min，20 min）去除沉淀，上清经双层滤纸过滤后灭菌（121℃，20 min），得到人工发酵的中药原液。

1.4 指标检测

发酵样品外包检测全部冷链配送，微量元素检测由陕西省生物农业研究所渭南大荔基地完成，抗氧化活性检测由杭州晶百检测技术有限公司完成，基于代谢组的中药有效成分由上海阿趣生物科技有限公司完成。

1.4.1 微量元素检测微量元素检测参照《食品中钙的测定GB5009.92—2016》《食品中铁的测定GB5009.90—2016》《食品中镁的测定GB5009.241—2017》《食品中铜的测定GB5009.13—2017》《食品中锌的测定GB5009.14—2017》等标准。

1.4.2 抗氧化活性成分检测超氧化物歧化酶（SOD）活性检测：参考《保健食品中超氧化物歧化酶（SOD）活性的测定GB/T5009.171—2003》；清除DPPH自由基能力的测定：参照文献[12]进行；羟基自由基清除作用的测定：参照文献[13]进行；总多酚的测定：参考文献[14]进行；抑菌活性的测定：牛津杯琼脂扩散法[15]。基于代谢组的中药有效成分分析：采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技术分析方法。

2 结果与分析

2.1 不同处理方式对JGZF中微量元素质量浓度的影响

微量元素是中草药组分的重要组成部分，其不仅可以作为人体必需的营养物加以补充，还可能具有特殊的生物活性[16]。微量元素除了游离移动状态存在形式，还有一部分主要存在于植物的细胞壁中。

对直接熬制、自然发酵以及人工发酵3种方式得到的JGZF药液的5种常见微量元素质量浓度进行检测，结果如图1所示。JGZF人工发酵液中微量元素质量浓度顺序为：钙（10.23 mg/L）＞铁（5.74 mg/L）＞镁（2.73 mg/L）＞锌（1.91 mg/L）＞铜（0.24 mg/L）。跟直接熬制相比，JGZF经发酵（自然发酵和人工发酵）处理后，微量元素（钙、铁、锌、铜）的含量得到了显著提高。由于两种发酵方式在熬制前均有浸泡和酶解的步骤，充分的浸泡以及复合酶对药材中的纤维素及半纤维素等物质的降解，再加上发酵过程中微生物的快速生长也会促使JGZF溶出更多的微量元素。结果显示，人工发酵与直接熬制相比，锌元素提高了7.3倍，铜元素提高了6.8倍，铁元素提高了3.7倍，钙元素提高了2.2倍。

图1 不同处理方式对JGZF中微量元素质量浓度的影响Fig.1 Effects of different treatments methods on the contents of trace elements in JGZF

2.2 不同处理方式对JGZF体外抗氧化活性的影响

中药的酚类、黄酮、生物碱、多糖、皂苷等有效成分均具有较好的抗氧化活性，可调节和增强机体特异性及非特异性免疫功能，抑制自由基的产生，或直接对抗自由基对细胞及组织的损伤作用[17]。实验采用紫外-可见分光光度计检测药液的过氧化物歧化酶SOD活性、DPPH自由基的清除能力、羟基自由基的清除能力以及总多酚含量来评价不同处理方式对JGZF体外抗氧化活性的影响。

本实验条件下，自然发酵方式的JGZF药液中生长的微生物经镜检主要是酵母菌和少许杂菌，而人工发酵好氧阶段接入复合酵母菌，厌氧阶段接入复合乳酸菌。酵母菌本身就能代谢出具抗氧化功能的甘露聚糖等物质，而且微生物在发酵代谢过程中分泌的胞外酶可将药物成分分解转化，会产生种类丰富的初生或次生代谢产物，有些代谢产物本就是很好的活性物质[18]。此外，以JGZF中药液中的一些代谢产物为前体，再经过一系列酯化、氧化、葡萄糖基化等多种生物转化途径后，也会促使生成新的活性成分。由图2可见，跟直接熬制相比，JGZF经自然发酵和人工发酵处理后，SOD活性和羟基自由基的清除能力均有提高。此外人工发酵的另外两个抗氧化活性指标（DPPH自由基的清除能力和总多酚含量）也有显著提高，分析原因如下：厌氧阶段接入的乳酸菌具有抵抗氧胁迫、调控信号通路途径、清除自由基系统、抑制脂质过氧化，具有一定的抗氧化能力[19]。人工发酵接入的菌种更有针对性，采用好氧与厌氧微生物的多级发酵方式更有利于抗氧化物质的产生和富集。

图2 不同处理方式对JGZF中活性成分的影响Fig.2 Effects of different treatments methods on the active ingredients in JGZF

检测结果显示，JGZF人工发酵液中的体外抗氧化活性结果为：SOD活性35.7 U/mL，DPPH自由基的清除能力51.4%，羟基自由基的清除能力117.6%，总多酚质量浓度为5.65×103μg/mL。与直接熬制相比，SOD活性提高了1.5倍，DPPH自由基的清除能力提高了2.2倍，羟基自由基的清除能力提高了4.2倍，总多酚含量提高了2.2倍。

2.3 不同发酵方式对JGZF抑菌活性的影响

食源性疾病对人类健康造成严重的危害，有60%以上的食源性疾病为细菌性致病菌污染食物所致[20]。采用牛津杯琼脂扩散法测算JGZF药液对4种标准菌株（金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、志贺氏菌、沙门氏菌）的抑菌圈直径，考察3种不同处理方式（直接熬制、自然发酵、人工发酵）对JGZF中药液抑菌活性的影响。

结果如图3所示，跟直接熬制相比，自然发酵JGZF对沙门氏菌和大肠杆菌的抑制效果得到了显著提高。其中，对沙门氏菌的抑菌效果提高了2.5倍，对大肠杆菌的抑菌效果提高了2.3倍。而对志贺氏菌的抑菌效果几乎不变，对金黄色葡萄球菌的抑菌活性略有下降。人工发酵JGZF和直接熬制相比，沙门氏菌的抑菌效果提高了2.2倍，大肠杆菌的抑菌效果提高了1.9倍，而志贺氏菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果却略有降低。

图3 不同发酵方式对JGZF抑菌活性的影响Fig.3 Effects of different treatments methods on antibacterial activity of JGZF

对结果分析可知，酶降解纤维素、木质纤维素和益生菌发酵可促进药液释放更多的抑菌活性成分，而且益生菌自身代谢系统有可能产生了新的抗菌活性物质[21]，例如厌氧发酵过程中产生的乳酸、丁酸等一些有机酸[22]，也可能是能增强药液抑菌活性的原因之一。此外，发酵过后部分抑菌活性有所降低的原因推测可能与微生物将一些抑菌活性物质转化为无活性的物质有关。综上所述，中药组分和选用的菌种是直接影响中药发酵液具体抑菌功能的两大因素。

2.4 不同处理方式对JGZF主要有效组分的影响

中药发酵炮制过程也是中药化学成分变化及药效偏转的过程，单一化学成分研究很难反映炮制产品整体质量的变化。而对中药液进行高通量检测，运用植物代谢组学技术对海量数据进行模式识别，可以对炮制品化学物质基础进行全面研究[23]。作者采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技术对药液样品进行数据检测、提取、分类及识别，重在考察不同处理方式对JGZF主要有效组分的影响。

经检测，人工发酵JGZF中最多的有效成分如图4所示，依次为：牛膝皂苷＞柠檬酸＞壬二酸＞蜕皮激素＞齐墩果酸＞肉桂酸＞金盏花苷E＞蒺藜皂苷K＞菟丝子糖苷酸A3＞地骨皮甲素＞甜菜碱（三甲基甘氨酸）＞香豆素糖苷＞竹节参皂苷IVA＞山奈酚3-龙胆双糖苷＞硼替佐米（二肽）＞棕榈酸甲酯＞川芎内酯＞L-酪氨酸＞肉桂丙烯醛＞菟丝子糖苷酸A2。将上述20种主要的有效成分进行归类，详见表1。

图4 不同处理方式对JGZF主要有效组分的影响Fig.4 Effects of different treatments methods on the main medicinal ingredients of JGZF

表1 人工发酵JGZF中的主要药效成分Table 1 Main medicinal ingredients in artificially fermented JGZF

由图4还可以看出，牛膝皂苷和柠檬酸是JGZF人工发酵液中含量最高的两种药效物质，含量对比：人工发酵＞直接熬制＞自然发酵，分析原因可能跟酶解过程增加牛膝皂苷的溶出以及人工发酵接入乳酸菌可促使葡萄糖转化成部分柠檬酸[24]有关。而自然发酵的微生物生长除了酵母菌还会有其他杂菌，这可能是导致牛膝皂苷前体被降解的原因。同时也能看出蜕皮激素、香豆素糖苷、异麦芽糖、金丝桃苷等在两种方式发酵后比直接熬制的含量降低，应该跟两种发酵中都存在酵母菌有关，具体机理和转化途径待进一步研究分析。

人工发酵前后JGZF药液中药效成分的变化结果如图5所示。L-苯丙氨酸（人体必需氨基酸）、黄芩素（抗炎）、色胺（血清张力素）、硬脂酸（润滑液）、Tribestin（睾丸激素）和Prototribestin（睾丸激素）的含量增加了上亿倍；Parvispinoside C（蒺藜皂苷）的含量增加了上千倍；双氯非那胺（青光眼药）和桃叶珊瑚苷（护肝）的含量增加了数百倍。同时，人工发酵处理后某些物质的含量也被降低了。比如，五味子苷B（蒺藜皂苷，活血化瘀、通经活络）、去甲基蟛蜞内酯（香豆素，抗炎）、7-羟基香豆素（解痉镇痛）和脱乙酰谷氨酸（抗炎镇痛）的含量降低了上亿倍；槲皮素-3-O-木糖苷（刺激神经中枢）、甘油二酯、紫云英（黄芪素，抗炎、抗氧化）、氯法齐明（抗炎药）、芦丁、多肽、氨基香豆素（抗菌药）和松酯醇二葡萄糖苷（杜仲木脂素，镇痛药）的含量降低了数百倍。

图5 人工发酵前后JGZF中有效成分的变化Fig.5 Changes of medicinal ingredients in JGZF before and after artificial fermentation

3 结语

1）跟直接熬制相比，中药方剂JGZF经自然发酵和人工发酵处理后，其微量元素锌、铜、铁和钙的含量得到了显著提高，这是由于自然发酵和人工发酵方式中浸泡、酶解步骤以及微生物的快速生长促进了药液中微量元素的溶出。

2）人工发酵能显著提高JGZF的体外抗氧化活性。与直接熬制相比，人工发酵JGZF药液中SOD活性提高了1.5倍，DPPH自由基的清除能力提高了2.2倍，羟基自由基的清除能力提高了4.2倍，总多酚含量提高了2.2倍。微生物在发酵代谢过程中会产生种类丰富的初生或次生代谢活性产物，经过一系列酯化、氧化、葡萄糖基化等生物转化途径后，生成新的活性成分。而且有针对性性的人工接种多级发酵更有利于抗氧化活性物质的产生。

3）发酵后的JGZF中药液对沙门氏菌和大肠杆菌的抑菌活性更强，但对志贺氏菌和金黄色葡萄球菌的抑菌活性不变或略有降低。生物酶降解纤维素等、益生菌发酵均可促使药液释放或者产生更多抑菌成分，同时微生物也可能将一些抑菌活性物质转化为无活性物质。

4）基于代谢组学技术的分析，结果表明JGZF经人工发酵后，人体必需氨基酸L-苯丙氨酸、抗炎物质黄芩素等药效物质含量显著增加；五味子苷B、7-羟基香豆素、农药残留等含量有显著降低。中药发酵过程会产生或者降解一些药效物质，从而导致药效含量有不同的变化。有效成分、非有效成分以及其他特殊物质与发酵微生物之间的相互作用机制、生物转化途径有待更深入的研究。

总体来说，微生物发酵炮制，尤其是人工定向发酵可以促进中药液微量元素的溶出、有利于抗氧化活性物质的产生、增强了药液对部分致病菌的抑菌活性、提高了部分药效成分含量并且降低了部分农药残留，对中药材的减毒增效具有积极意义。