PB实验及响应面法优化山刺玫果总黄酮的提取工艺

侯少平，侯敏娜，周 蕊

(陕西国际商贸学院，陕西 西安 712046)

山刺玫(RosadavuricaPall.)，又名野玫瑰，是蔷薇科蔷薇属的一种落叶小灌木，生长于树林边缘，该植物耐旱，可在瘠薄区域生长，主要分布在东北地区(小兴安岭以南)[1-2]。山刺玫果具有健运脾气、调理月经、消食、敛肺止咳的功效，对胃积食、动脉粥样硬化、腹痛、月经不调、肺咳都有疗效[3]。山刺玫果具有很高的营养价值，可直接加工成果酱类食品，也是保健品以及功能性饮品的原料[4]。

目前，关于蔷薇属植物刺玫果的研究较多，而针对山刺玫果的研究较少。山刺玫果与刺玫果属同类不同品种的植物果实，其作为鄂伦春族民族用药，同样具有较显著的药理作用。鉴于此，作者采取Plackett-Burman(PB)实验结合响应面法优化山刺玫果总黄酮的超声辅助提取工艺，为山刺玫果的开发应用提供科学依据。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

山刺玫干燥成熟果实，由西安交通大学医学部药学院天然药物化学实验室提供。

芦丁标椎品(批号：20140331)，上海源叶生物科技有限公司；抗坏血酸、甲醇、乙醇、乙酸乙酯，均为分析纯；实验用水为蒸馏水。

TU-1810型紫外分光光度计，北京普析仪器有限责任公司；HH-S4型电热恒温水浴锅，北京科伟永兴仪器有限公司；SHZ-Ⅲ型循环水真空泵，郑州赛特利斯；RE-2000E型旋转蒸发仪，巩义瑞力仪器设备有限公司；5～50 μL移液器，中国大龙；100～1 000 μL移液器，美国Thermo Fisher；DZF-6021型真空干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司；SQP型万分之一天平，北京赛多利斯；800Y型粉碎机，皇代；YP202N型电子天平，上海精科。

1.2 芦丁标准溶液的配制

精密称取芦丁标准品5.0 mg，105 ℃下干燥至恒重，加甲醇溶解并定容至50 mL，摇匀，即得浓度为0.1 mg·mL-1的芦丁标准溶液[5-6]。

1.3 芦丁标准曲线的绘制

分别精密吸取芦丁标准溶液1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，采用NaNO2-Al(NO3)3法测定510 nm处吸光度，以芦丁浓度(c)为横坐标、吸光度(A)为纵坐标绘制标准曲线(图1)，拟合得线性回归方程为：A=9.9364c+0.0039，R2=0.9996，表明芦丁浓度在0.01～0.05 mg·mL-1范围内与吸光度线性关系良好[5]。

图1 芦丁的标准曲线

1.4 提取液中总黄酮得率的测定

取山刺玫干果粉50 g，在相应条件下提取。提取液经过滤后蒸干，取定量干膏用少量一定浓度乙醇溶解并转移至50 mL容量瓶中，稀释至刻度；精密量取1 mL提取液稀释液，采用NaNO2-Al(NO3)3法测定510 nm处吸光度，根据标准曲线方程计算总黄酮含量，然后根据稀释倍数计算山刺玫果总黄酮得率(mg·g-1)[7]。

1.5 山刺玫果总黄酮提取工艺的优化

1.5.1 最陡爬坡实验[8-9]

影响山刺玫果总黄酮的提取因素包括提取功率、提取次数、提取时间、提取温度、料液比、乙醇浓度、pH值等。通过查阅文献，结合预实验结果初步确定各影响因素的取值范围，再通过最陡爬坡实验找到实验顶点(最大响应值)即为因素的+1点，根据1.25倍原则得出-1点，即确定各因素的最佳取值范围。

1.5.2 PB实验

使用Minitab 16软件设计3个中心点和12组实验，每组实验重复3次，结果取平均值。

1.5.3 响应面实验

在PB实验的基础上，选取P值<0.05的因素作为响应面实验的设计因素，采用Box-Behnken设计响应面实验，确定山刺玫果总黄酮的最佳提取工艺。

1.6 数据处理

采用Design-Expert V8.0.6软件、Minitab 16软件和Excel 2010绘制图表进行数据处理及分析。

2 结果与讨论

2.1 PB实验结果

经预实验确定影响总黄酮得率的7个影响因素的取值范围：提取次数为1～6次、提取液pH值为2.0～5.0、料液比为1∶(6～16)、提取功率为100～200 W、提取温度为10～80 ℃、乙醇浓度为20%～100%、提取时间为10～60 min，共设计6组实验，结果见表1。

表1 最陡爬坡实验设计与结果

从表1可以看出，第4组山刺玫果总黄酮得率最高。因此，选择第4组作为实验顶点(+1)，根据1.25倍原则得出各因素的另一水平点(-1)，PB实验的因素与水平见表2，PB实验设计与结果见表3，PB实验的方差分析见表4。

表2 PB实验的因素与水平

表3 PB实验设计与结果

表4 PB实验的方差分析

对表3数据进行拟合，在双因素交互作用不明显的前提下评估其主效应下的7个因素，得到其回归方程为：Y=8.6275-0.1242X1-0.2308X2+ 0.0242X3+ 0.8208X4+ 0.3608X5-0.1908X6+ 0.0858X7。

2.2 响应面实验结果

2.2.1 响应面实验设计及结果

响应面实验的因素与水平见表5，响应面实验设计与结果见表6，响应面实验的方差分析见表7。

表5 响应面实验的因素与水平

表6 响应面实验设计与结果

表7 响应面实验的方差分析

响应面设计采用5个中心点，29组实验来进行，重点考察各因素及因素之间的交互作用对山刺玫果总黄酮得率的影响，该模型的回归方程为：Y=10.26+0.92A+0.36B-0.19C+0.22D+0.060AB+0.20AC+0.065AD-0.60BC+0.25BD-0.26CD-1.16A2-0.81B2-0.71C2-0.81D2。

2.2.2 各因素交互作用对山刺玫果总黄酮得率影响的响应面图及等高线图(图2)

图2 各因素交互作用对山刺玫果总黄酮得率影响的响应面图及等高线图

从图2a可知，从等高线的形状来看，其椭圆程度不大，说明提取功率与提取温度的交互作用较弱；从曲面弯曲程度来看，提取功率的响应值曲面弯曲程度大，提取温度的响应值曲面则较为平缓，说明提取功率较提取温度对响应面值影响显著，随两因素数值的增大，山刺玫果总黄酮得率均呈先增大后减小的趋势，截取山刺玫果总黄酮得率值最大点两端的片段数据，可以初步确定最佳提取功率取值范围在136～152 W、提取温度取值范围在45～55 ℃。

从图2b可知，从等高线的形状来看，其椭圆程度不大，说明提取功率与提取液pH值的交互作用较弱；从等高线的疏密程度来看，靠近提取功率的等高线较靠近提取液pH值的等高线密集，则表明提取功率比提取液pH值对山刺玫果总黄酮得率的影响大；从曲面弯曲程度来看，提取功率的响应值曲面图弯曲程度大，提取液pH值的响应值曲面则较为平缓，说明提取功率较提取液pH值对响应面值影响显著，随两因素数值的增大，山刺玫果总黄酮得率均呈先增大后减小的趋势，截取距山刺玫果总黄酮得率值最大点较近两端的片段数据，可以初步确定最佳提取功率取值范围在136～152 W、提取液pH值取值范围在3.40～3.60。

从图2c可知，从等高线的形状来看，其椭圆程度不大，说明提取功率与乙醇浓度的交互作用较弱；从等高线的疏密程度来看，靠近提取功率的等高线较靠近乙醇浓度的等高线密集，表明提取功率比乙醇浓度对山刺玫果总黄酮得率的影响大；从曲面弯曲程度来看，提取功率的响应值曲面弯曲程度大，乙醇浓度的响应值曲面则较为平缓，说明提取功率较乙醇浓度对响应面值影响显著，随两因素数值的增大，山刺玫果总黄酮得率均呈先增大后减小的趋势，截取距离山刺玫果总黄酮得率值最大点最近两端的片段数据，可以初步确定最佳提取功率取值范围在136～152 W、乙醇浓度取值范围在55%～65%。

从图2d可知，从等高线的形状来看，呈椭圆形，说明提取温度与提取液pH值的交互作用较强；从等高线的疏密程度来看，靠近提取温度的等高线较靠近提取液pH值的等高线密集，表明提取温度比提取液pH值对山刺玫果总黄酮得率的影响大；从曲面弯曲程度来看，提取温度的响应值曲面弯曲程度大，提取液pH值的响应值曲面则较为平缓，说明提取温度较提取液pH值对响应面值影响显著，随两因素数值的增大，山刺玫果总黄酮得率均呈先增大后减小的趋势，截取山刺玫果总黄酮得率值最大点两端的片段数据，可以初步确定最佳提取液pH值取值范围在3.40～3.80、提取温度取值范围在50～60 ℃。

从图2e可知，从等高线的形状来看，其椭圆程度不大，说明提取液pH值与乙醇浓度的交互作用较弱；从等高线的疏密程度来看，靠近乙醇浓度的等高线较靠近提取液pH值的等高线密集，则表明乙醇浓度比提取液pH值对山刺玫果总黄酮得率的影响大；从曲面弯曲程度来看，乙醇浓度的响应值曲面弯曲程度大，提取液pH值的响应值曲面则较为平缓，说明乙醇浓度较提取液pH值对响应面值影响显著，随两因素数值的增大，山刺玫果总黄酮得率均呈先增大后减小的趋势，截取距离山刺玫果总黄酮得率值最大点最近两端的片段数据，可以初步确定最佳乙醇浓度取值范围在55%～65%、提取液pH值取值范围在3.40～3.60。

从图2f可知，从等高线的形状来看，其椭圆程度不大，说明提取温度与乙醇浓度的交互作用较弱；从等高线的疏密程度来看，靠近提取温度的等高线较靠近乙醇浓度的等高线密集，则表明提取温度比乙醇浓度对山刺玫果总黄酮得率的影响大；从曲面弯曲程度来看，提取温度的响应值曲面弯曲程度大，乙醇浓度的响应值曲面表现则较为平缓，说明提取温度较乙醇浓度对响应面值影响显著，随两因素数值的增大，山刺玫果总黄酮得率均呈先增大后减小的趋势，截取山刺玫果总黄酮得率值最大点最近两端的片段数据，可以初步确定最佳乙醇浓度取值范围为55%～65%，提取温度取值范围在45～55 ℃。

2.2.3 最佳工艺的确定及验证实验

基于以上分析，确定山刺玫果总黄酮的最佳提取工艺为：提取功率148.09 W、提取温度52.06 ℃、提取液pH值3.47、乙醇浓度62.38%，在此条件下，预测总黄酮得率为10.599 6 mg·g-1。根据实际可操作性原则，将最佳提取工艺优化为：提取功率150 W、提取温度55 ℃、提取液pH值3.5、乙醇浓度60%。在最佳提取工艺条件下进行3组平行实验，得到山刺玫果总黄酮得率分别为10.72 mg·g-1、10.98 mg·g-1、10.20 mg·g-1，平均值为10.63 mg·g-1，与预测值相差0.03 mg·g-1，说明工艺数据可靠，该模型具有比较好的实验预测性。

3 结论

通过PB实验和响应面法对山刺玫果总黄酮的超声辅助提取工艺进行优化，确定最佳提取工艺为：提取功率150 W、提取温度55 ℃、提取液pH值3.5、乙醇浓度60%。在此条件下，山刺玫果总黄酮得率为10.63 mg·g-1。本研究先确定影响山刺玫果总黄酮的各个因素的最佳取值范围，然后进行最陡爬坡实验及PB实验，选取显著因素再进行Box-Behnken设计响应面实验，避免因响应面法中影响因素选取不当而造成交互作用不明显等现象。