熵权模糊综合评判模型评价不同促透剂对刺山柑凝胶剂渗透性的影响

古丽娜·卡里曼江，阿布都艾则孜·艾尔肯，阿丽亚·依拉木，美丽万·阿不都热依木，木巴拉克·伊明江

(新疆医科大学药学院，新疆 乌鲁木齐830000)

类风湿性关节炎 (rheumatoid arthritis,RA)是一种以慢性、炎性、进行性、侵袭性及系统性关节炎为主要表现的自身免疫疾病[1]。抗风湿中草药传统剂型存在生物利用度低、剂量大、起效慢、用药不方便等不足。中药凝胶剂是近年来的新兴剂型,作为中医药内病外治法的良好剂型用于治疗类风湿性关节炎。

刺山柑(CapparisspinosaL.)为白花菜科山柑属藤本植物，又名野西瓜、老鼠瓜、槌果藤[2]，具有祛风散寒、除湿、镇痛、消肿的功效[3]。刺山柑化学成分复杂，杨丽等[4]以刺山柑果凝胶膏剂的有效成分芦丁为指标物质，对促透剂进行了筛选。

作者所在课题组前期确定了刺山柑凝胶剂处方及制备工艺，但未对促透剂进行筛选。而透皮吸收的指标参数丰富并具有模糊特征，不能依据某单一指标进行评价。熵权法是一种客观的体系权重的计算方法，可有效降低主观随意性对权重值的干扰，提高权重的准确度[5]。模糊综合评价法将指标数值与隶属度对应,用隶属度来反映指标的好坏,能够有效解决由系统本身状态的模糊性和内部的复杂性所带来的难以准确评价的问题,具有结果清晰、系统性强的特点[6]。在前期刺山柑凝胶剂剂型研究的基础上，作者分别选择氮酮、薄荷醇、丙二醇、油酸作为促透剂，以稳态流量(Jss)、渗透系数(Kp)、滞后时间(Tlag)、增渗倍数(ER)、皮肤残留量(Qs)为评价指标，采用熵权模糊综合评判模型研究不同促透剂及其用量对刺山柑凝胶剂中有效成分芦丁透皮吸收特征的影响，以期获得具有最佳促透效果的促透剂，为提高刺山柑凝胶剂的药效发挥奠定基础。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

刺山柑药材，购于百草堂中药房，由新疆医科大学药学院美丽万·阿不都热依木教授鉴定为白花菜科山柑属。

芦丁标准品(批号111G022，质量分数≥98%)，北京索莱宝科技有限公司；氮酮(批号C11290675)、油酸(批号C10615044)、丙二醇(批号C11276571)、薄荷醇(批号C11169169)，上海麦克林生化科技有限公司；其它试剂均为市售分析纯。

高效液相色谱仪，Agilent；TP-6型智能透皮试验仪、改良型Franz立式扩散池，天津鑫州科技有限公司；电子分析天平，深圳无限量衡器有限公司；数控超声波清洗器，昆山超声仪器有限公司。

1.2 动物

SPF级SD雄性大鼠[质量合格证号SCXK(新)2018-0002]，购于新疆医科大学动物实验中心。

1.3 刺山柑凝胶剂的制备

称取适量卡波姆940，加甘油调成糊状，再加入刺山柑果实浓缩液，搅匀，加适量蒸馏水溶胀，静置过夜，备用。将无水乙醇、促透剂、增溶剂、防腐剂加入凝胶中，充分搅拌后滴加三乙醇胺，调节pH值至6～7，即得刺山柑凝胶剂[7]。

1.4 体外透皮实验

1.4.1 动物离体皮肤的制备

将大鼠脱臼处死后，刮去腹部的毛，剪下腹部皮肤，仔细剔除皮下脂肪和粘连物，用生理盐水清洗干净，剪成适当大小，-20 ℃保存备用。使用前自然解冻，并检查大鼠皮肤的完整性，确保无任何破损。

1.4.2 接收液的筛选

分别用生理盐水、10%乙醇-生理盐水、20%乙醇-生理盐水、磷酸缓冲液(pH值7.4，下同)、10%乙醇-磷酸缓冲液、20%乙醇-磷酸缓冲液溶解已知量的芦丁，进样分析。结果显示，采用20%乙醇-磷酸缓冲液溶解芦丁，溶解度可达85.2%。故以20%乙醇-磷酸缓冲液作为接收液。

1.4.3 含不同促透剂的刺山柑凝胶剂的制备

分别以氮酮、薄荷醇、丙二醇、油酸为促透剂，制备含不同促透剂的刺山柑凝胶剂，以不含促透剂的刺山柑凝胶剂(F0)作为对照，处方见表1。

表1 含不同促透剂的刺山柑凝胶剂处方

1.4.4 药物累积渗透量的测定

将大鼠皮肤自然固定在改良型Franz立式扩散池的供应室和接收室(提前加入转子)之间，有效扩散面积为1.8 cm2，角质层面向供应室，上下夹紧后在供应室中加入刺山柑凝胶剂1.0 g，均匀涂抹于皮肤表面，向接收室内注入预热过的20%乙醇-磷酸缓冲液作为接收液，确保液面与皮肤接触无气泡，设置透皮试验仪温度为(37.0±0.5) ℃，转速为(300±1) r·min-1，分别于2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h抽取接收液3.0 mL，同时补加等温等体积的新鲜接收液。将接收液用氮气吹干后加入甲醇溶解，取上清液用0.45 μm微孔滤膜过滤后采用HPLC法测定，按式(1)计算药物单位面积累积渗透量(Q，μg·cm-2)：

(1)

式中：cn、ci分别为n、i时间点的药物质量浓度，μg·mL-1；V为接收液体积,mL；Vi为取样量,mL；S为扩散渗透面积,cm2。

1.5 药物储库效应实验

当体外透皮实验完成后，从供应室中取出刺山柑凝胶剂,从改良型Franz立式扩散池中取出大鼠皮肤，用接收液清洗大鼠皮肤表面，去除残留药物，再用滤纸吸干。将大鼠皮肤用手术剪刀剪成碎片，用研钵进一步研磨。将研磨好的皮肤组织放入离心管中，加入3.0 mL接收液，涡旋匀浆5 min，再常温超声处理30 min后于3 000 r·min-1离心5 min。收集上清液,氮气吹干溶剂，再用甲醇溶解，采用HPLC法测定药物的皮肤残留量(Qs，μg·cm-2)。

1.6 刺山柑凝胶剂中芦丁含量的测定

1.6.1 溶液的制备

芦丁标准溶液：精密称取芦丁标准品0.002 0 g于5 mL棕色容量瓶中，加入甲醇稀释至刻度，即得0.4 mg·mL-1的芦丁标准溶液。

供试溶液：取各时间点的透皮接收液，将接收液用氮气吹干后，加入甲醇溶解，取上清液用0.45 μm微孔滤膜过滤，即得供试溶液。

1.6.2 色谱条件

岛津ODS-2 C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为0.2%磷酸水溶液-乙腈(80∶20，体积比)；流速1 mL·min-1；检测波长360 nm；进样量20 μL；柱温25 ℃。空白接收液、芦丁标准溶液、供试溶液的HPLC图谱见图1。

图1 空白接收液(a)、芦丁标准溶液(b)、供试溶液(c)的HPLC图谱

1.7 熵权模糊综合评判模型综合评价

1.7.1 评价对象集、因素集和评语集的确定

依据促透剂评价指标和种类[8-9]，设置对象集=(促透剂促透能力)，因素集=(Jss、Kp、ER、Tlag)，评语集=(优、良、中、一般、差)。

1.7.2 模糊评判矩阵的确定

设F0组的Jss、Kp、ER、Tlag数值等级为一般，按式(2)计算各指标等级差，其等级标准见表2。

表2 各评价指标的等级标准

(2)

选择梯形模型分布隶属函数,从而确保各组模糊评判矩阵有合适的隶属函数，对不同促透剂的各指标按式(3)计算评价矩阵R：

(3)

1.7.3 熵权法确定评价指标的权重系数

在具有i个评价指标、j个评价标准的系统中，根据定性和定量的原则得到矩阵R，根据熵权法按式(4)计算不同促透剂各评价指标的权重值：

(4)

式中：Hi为第i个指标的熵；Wi为第i个指标的权重(0≤Wi≤1,∑Wi=1)。

2 结果与讨论

2.1 方法学考察

2.1.1 线性关系

精密吸取12.5 μL、25 μL、125 μL、250 μL、500 μL、1 000 μL芦丁标准溶液置于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，按1.6.2色谱条件进样测定。以芦丁浓度为横坐标、峰面积为纵坐标绘制标准曲线，拟合得线性回归方程为y=17.888x-3.0442，R=0.9999。表明，芦丁浓度在0.5～40 μg·mL-1范围内线性关系良好。

2.1.2 精密度

取芦丁标准溶液，按1.6.2色谱条件于同一天重复进样6次，考察日内精密度，计算芦丁峰面积的RSD值为1.34%，表明仪器精密度良好。

2.1.3 稳定性

取芦丁标准溶液，按1.6.2色谱条件分别于0 h、2 h、4 h、8 h、10 h、12 h进样测定，计算芦丁峰面积的RSD值为1.74%，表明溶液在12 h内稳定性良好。

2.1.4 加标回收率

精密吸取6份已知含量的透皮接收液，分别精密加入芦丁标准溶液，按1.6.2色谱条件进样测定，计算加标回收率为98.21%，RSD值为2.09%。

2.2 不同促透剂对刺山柑凝胶剂透皮吸收的影响

将时间-药物累积渗透量进行零级、一级、Higuchi方程、Ritger-Peppas动力学方程拟合，结果见表3。

表3 含氮酮刺山柑凝胶剂体外释药模型拟合结果

由表3可知，以各模型拟合方程的R2值接近1的程度来进行拟合方程最佳判断，确定刺山柑凝胶剂体外释药规律均符合Higuchi方程。根据Higuchi方程分别计算得到Jss、Kp、ER、Tlag，结果见表4。含不同促透剂刺山柑凝胶剂的皮肤残留量见图2。

表4 不同促透剂对刺山柑凝胶剂经皮吸收参数的影响

图2 含不同促透剂刺山柑凝胶剂的皮肤残留量

由表4、图2可知，在不含促透剂和含不同促透剂的刺山柑凝胶剂系列处方组中，1%氮酮组(F1)的Jss、Kp、ER最优；3%薄荷醇组(F5)的Tlag最优；1%油酸组(F8)的Qs最优。

2.3 熵权模糊综合评价分析

按熵权法得到各评价因素的权重分配W=[w1,w2,w3,…,wn]，不同促透剂各评价指标的权重系数见表5。

表5 不同促透剂各评价指标的权重系数

根据各评判指标的权重系数通过模糊变换，可得到论域上的一个模糊子集，即综合评判结果：B=W，R=[b1,b2,b3,…,bm]，不同促透剂对刺山柑凝胶剂促透作用的归属见表6。

表6 不同促透剂对刺山柑凝胶剂促透作用的归属

从表6可知，1%氮酮、3%氮酮、5%氮酮的评语分别为良、优、一般，其评语的最大隶属度分别为0.619 6、0.716 4、1.025；1%薄荷醇、3%薄荷醇、5%薄荷醇的评语分别为中、优、一般，其评语的最大隶属度分别为0.667 3、0.669 6、0.745 6；5%丙二醇的评语为一般，其评语的最大隶属度为1.344；1%油酸、3%油酸、5%油酸的评语分别为良、良、一般，其评语的最大隶属度分别为0.925 4、1.305、0.584 4；2%氮酮+2%薄荷醇的评语为中，其评语的最大隶属度为1.058，2%氮酮+2%丙二醇的评语为中，其评语的最大隶属度为0.994 4。表明，3%氮酮对刺山柑凝胶剂具有最佳的透皮吸收促进作用。

2.4 讨论

在体外透皮实验中，接收液的选择尤为重要。较常使用的接收液主要是磷酸缓冲液、生理盐水等。对于水溶性差的药物则常会在接收液中添加一些非生理性成分如乙醇、聚乙二醇、丙二醇[10]等，以增大药物的溶解度。刺山柑凝胶剂中活性成分芦丁在水中的溶解度较小,本研究以磷酸缓冲液作为接收液并分别加入不同体积分数乙醇，在增大芦丁溶解度的同时可使角质层膨胀疏松，增加皮肤的通透性,促进透皮，从而减少时滞，缩短实验时间。在考察芦丁在不同溶液中的溶解度时发现，20%乙醇-磷酸缓冲液可增大芦丁的溶解度，且乙醇体积分数对皮肤正常生理功能的影响较小，故以此为接收液。

刺山柑作为传统中药，在民间以果实、根皮等捣碎敷在患处使用，以治疗痛风、关节肿胀疼痛等病况。作者所在课题组以此为基点进行系列研究[7,11]，以促进制剂开发。但经皮给药的局限在于皮肤的屏障作用，角质层屏障效应最强，易阻滞药物的经皮吸收[12]。本研究为提高刺山柑凝胶剂的生物利用度，分别考察了氮酮、薄荷醇、丙二醇、油酸及其联合使用对经皮吸收的影响，结果显示不同促透剂对其均有促进作用。但各促透剂的促透指标各有优劣，并不能就单一指标评价各促透剂的综合促透能力，因此采用熵权模糊综合评判模型进行评价筛选，既能避免主观意识对结果的干扰，也能将评价指标进行模糊变化再使其定量化，客观有效得出清晰准确的结果。

3 结论

采用改良型Franz立式扩散池进行体外透皮实验，通过HPLC法测定刺山柑凝胶剂中有效成分芦丁含量，以稳态流量、渗透系数、滞后时间、增渗倍数、皮肤残留量为评价指标，基于熵权模糊综合评判模型研究不同促透剂及其用量对刺山柑凝胶剂中芦丁透皮吸收特征的影响，优化刺山柑凝胶剂处方。结果表明，刺山柑凝胶剂体外释药规律符合Higuchi方程，透皮速率恒定；熵权模糊综合评价显示3%氮酮的促透能力最佳，其评语为优的最大隶属度为0.716 4。3%氮酮能有效促进刺山柑凝胶剂中芦丁的体外透皮吸收，可作为刺山柑凝胶剂的促透剂。