免疫检查点在肝细胞癌免疫逃逸中的作用研究进展

陈柳汛 刘旭东 张杨宇博 郑辉 梅浙川

肝细胞癌(HCC)是常见的消化系统疾病,是我国第五大常见肿瘤,第二大癌症致死病因。在全球范围内,肝细胞癌已成为第六大最常见肿瘤和第四位致死原因。近年来,随着精准医学的发展,肝细胞癌的免疫治疗越来越受到关注。当机体发生肿瘤时,免疫系统可以识别并清除微环境中的肿瘤细胞,但在病理条件下,肿瘤细胞通过抑制人体免疫系统,使 T 细胞无法识别和杀伤肿瘤细胞,从而逃逸免疫系统的监视和清除。近年来,越来越多的研究证实,免疫检查点抑制剂(immune checkpoint blockade,ICB)可以通过解除免疫检查点的免疫抑制功能,去除肝癌细胞免疫逃逸作用,将免疫检查点抑制剂应用于临床,已成为抗肿瘤治疗最新手段。细胞毒性 T 淋巴细胞相关蛋白(CTLA-4)、程序性死亡蛋白-1(PD-1)、淋巴细胞活化基因-3(LAG-3)和 T 细胞免疫蛋白-3(TIM-3)是肿瘤免疫治疗最常靶向的免疫检查点,本文就近年来免疫检查点在肝细胞癌发生发展中的机制及其临床应用的最新研究进行综述。

一、肝癌肿瘤免疫

T 淋巴细胞是抗肿瘤免疫应答主要效应细胞。在正常情况下,初始 T 细胞能够识别由抗原提呈细胞(APC)结合的肿瘤抗原,并在共刺激信号分子作用下,激活 T 细胞表面受体胞内段免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM),然后激活MAPK或 NF/κB 信号通路[1],初始 T 细胞活化为效应 T 细胞,从而参与抗肿瘤免疫应答。近期研究表明,T 细胞在肿瘤组织内发挥抗肿瘤效应前,在淋巴结外能通过与新的APC 或其他淋巴细胞相互作用而受到二次调节,从而决定被激活的 T 细胞是否继续发挥肿瘤杀伤效应[2]。已有研究证实,肿瘤微环境(tumor microenvironment ，TME)含有大量免疫抑制细胞和分子,能诱导 T细胞上调免疫检查点受体的表达,导致 T 细胞丧失抗肿瘤功能,引发肿瘤细胞免疫逃逸[3]。免疫抑制分子中,CTLA-4、PD-1、LAG-3 及TIM-3是近年来的研究热点。此外,免疫抑制性细胞在肿瘤细胞免疫逃逸中扮演了重要角色,其中调节性 T 细胞(Treg)和髓源抑制性细胞(MDSCs)是免疫抑制性细胞中最重要的成分。临床研究提示,肿瘤组织中的 Treg 含量越高,则肝癌患者预后越差[4]。因此 Treg 在肝癌发生发展中起重要作用。骨髓源性抑制细胞(MDSCs)在肿瘤微环境(TME)中能促进血管生成和免疫抑制[5]。临床研究在 HCC 患者外周血与对照组相比,MDSCs 的相对数量与平均数量在 HCC 患者组中均高于对照组,靶向 MDSC 能够显著提高索拉非尼及免疫检查点抑制剂的抗肿瘤效应[6]。MDSCs 同样在肝癌发生发展中可能起着重要免疫抑制作用。学者们认为,在肿瘤微环境中,各种抑制性细胞或分子组成了一个复杂的调节网络,最终导致 T 细胞失能,肿瘤细胞不能得到杀伤或抑制,导致肝癌的发生及进展。

二、免疫检查点在肝癌免疫逃逸中的作用及临床价值

(一)CTLA-4 与肝癌免疫应答 CTLA-4、CD152是表达在多种免疫细胞的细胞膜上的表面蛋白,可以通过多种机制抑制 T 细胞的活化。CTLA-4 与 CD28 具有高度同源性,因此它可以通过与 CD28 竞争 APC 表面 B7 分子的结合位点,从而来发挥抑制 T 细胞的功能。此外,CTLA-4 也在 Treg 细胞膜上表达,通过增强 Treg 活性与分化来抑制 T 细胞活化,肝癌衍生 Treg可以干扰树突状细胞(DC)的功能,并在体外以细胞接触依赖的方式下调树突状细胞上的 CD80/CD86。此外 CTLA-4 还可以直接干扰树突状细胞从而促进肿瘤微环境中的免疫抑制[7]。研究发现,Fascin-1蛋白在DC细胞与APC细胞相结合形成免疫突触时发挥重要作用,Fascin-1是一种机动蛋白成束蛋白,而 CTLA-4 能诱导APC中Fascin-1依赖肌动蛋白移动至 Treg 结合区从而隔离Fascin-1 蛋白,使DC 细胞沉寂,但是具体的调节机制还尚不清楚。CTLA-4 在肝癌的发生发展也具有重要作用。有报道研究了 80 例 HCC 患者与 78 例正常对照者,采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法进行 CTLA-4 rs231775 多态性分析,结果发现 CTLA-4 基因型分布符合Hardy-Weinbery平衡,另外更为重要的是,研究组与对照组相比,HCC 组的 CTLA-4 的表达率明显高于对照组,关联分析同样表明基因型 AA 携带者 CTLA-4 水平最高(P<0.01)[8]。单克隆抗体Tremelimumab (CP-675206)可以针对人类细胞毒性 T 淋巴细胞相关抗原 4(CTLA-4 ),通过使用抗体 Tremelimumab可以阻断 CTLA-4 抑制性共刺激受体的信号通路,从而阻止 T 细胞失能,避免诱发肿瘤免疫逃逸,目前在临床应用于转移性黑色素瘤患者的治疗中取得较好的效果。对于治疗肝细胞癌这样的实体肿瘤,在临床研究中证实了利用 Tremelimumab 治疗的 HCC 患者较对照组的患者明显激活了 T 细胞的活性,发挥抗肝癌的效应[9]。CTLA-4 阻断剂的疗效与肿瘤的大小以及其免疫原性有重要的关系[9]。在一项临床研究中,David等对 39 例成年肝细胞癌患者连续实施 3 个月 Tremelimumab治疗,并按照Recist标准(1.1)对患者进行疗效评价,研究结果提示。通过计算,Tremelimumab 临床试验的反应率达到了 54.3%[9]。另一方面,该药物主要副作用为肾损害，包括急性(肉芽肿)肾小管间质性肾炎和免疫复合物肾小球肾炎,在给予全身性皮质类固醇治疗后肾功能可以恢复正常[10]。

(二)PD-1 在肝癌发生发展中的作用 程序性细胞死亡-1(PD-1)是 CD28 超家族的成员,并由 pdcd1基因编码，其与两个配体 PD-L1 或 PD-L2 相互作用时可以传递抑制性信号。作为一种抑制性受体，它通常表达在 CTL 细胞膜上,可被T 细胞相关性抗原和相关细胞因子诱导。最初 PD-1 是在凋亡细胞被发现,但随后发现，PD-1 可在效应 T 细胞上表达,甚至可在胸腺中的双阴性(CD4-、CD8-)T 细胞、自然杀伤 T 细胞(NKT)以及未成熟的朗格汉斯细胞中低表达。而 PD-1 的表达可受到 NFATc1 的调控。研究发现,PD-1 基因调节可以通过将 NFATc1 募集至 pdcd1 基因座上的调节元件而发生。在肿瘤进展过程中,肿瘤细胞可以增加PD-L1 的表达从而导致 T 细胞失能,最终实现肿瘤免疫逃逸。在 PD-1 细胞膜内结构域中具有两个酪氨酸残基,其余近膜端由免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)组成,而另一部分主要由基于免疫受体酪氨酸开关基序(ITSM)构成。当 PD-1 与其受体结合后,其下游酪氨酸残基被磷酸化,并招募蛋白酪氨酸磷酸(PTPs),如SHP2,从而使下游各通路关键的激酶去磷酸化,比如 SHP2 可以抑制ZAP70、P13K-AKT 和RAS-ERK等，从而对抗由 TCR-CD28 诱导的活化信号,最终引起效应T 细胞失能。

根据 PD-1 的抑制作用,在肝癌治疗中它可以作为治疗的重要靶点。研究发现肝细胞癌患者中,82%的 HCC 患者表达 PD-L1,对抗PD-1 治疗的反应率约为 19%,并且包括约 5%的完全缓解以及一些患者的持久获益[11]。将抗 PD-1 和 PD-L1 药物与索拉非尼联合治疗进展期肝癌的临床试验现在正在进行中。虽然在各项临床试验中结果显示了抗PD-1 与抗PD-L1 的有效性,但是总体的有效性约为20%,现在有超过 30 余项关于PD-1/PD-L1抑制剂与肝动脉插管栓塞化疗(TACE)、放疗和靶向药物等联合应用的临床应用的临床研究还在进行中[12],有望在治疗上取得更好的疗效。

(三)LAG-3 与肝癌免疫逃逸 淋巴细胞活化基因-3(LAG-3 )最初在活化的 T 细胞与NK细胞表面被发现,是 Ig 超家族的一员,后逐渐在 CD4+T 细胞、CD8+T细胞、树突状细胞(DC)、Treg 及 NK 细胞上发现 LAG-3 的表达[16]。在不同的 TIL 上检测到 LAG-3的过度表达，并有显著的免疫调节作用。作为一种免疫检查点控制蛋白,主要功能是负调节 T 细胞免疫。早期研究表明其抑制作用的配体,MHC-II被认为是通过其在胞外的氨基酸基与 LAG-3 结合[13]。此后的文献报道LAG-3 能够抑制CD4+T细胞与NK细胞的功能,但其并没有与MHC-II 发生结合[14],这些证据说明LAG-3不是通过 MHC-II发挥抑制作用的。最近有研究报道单克隆抗体可以 阻断肝纤维蛋白原(Fibrinogen-like protein，FGL-1)与LAG-3 的相互作用从而刺激肿瘤免疫[15],提示FGL-1是一种与MHC-II无关的LAG-3功能性配体,LAG-3 正是与FGL-1 相结合才发挥相应的生物学效应[14]。因此 LAG-3 抑制 T 细胞的功能主要是通过与肿瘤细胞上表达的FGL-1 相结合发挥抑制T 细胞功能的效应。肝癌细胞中 FGL-1 的表达明显增高,提示了 FGL-1 分子表达可能对肝癌发生发展有重要意义，Yarchaon等报道以 29 例肝癌切除术后患者为研究对象,对分别浸润在肝癌组织与正常中CD8+T细胞以及PD-1(+),T细胞和 LAG-3(+)T 细胞以及 PD-1(+)T 细胞进行免疫组化染色,结果显示 29 例患者中有 19 例(65%)发现 LAG-3 有阳性表达,肿瘤组织中的 LAG-3 表达显著高于正常肝组织[16]。提示 LAG-3 在肝癌的发生及发展可能存在重要作用。动物实验研究中证实抗 LAG-3 抗体不仅能促进效应 T 细胞的活性,而且能抑制 Treg 诱导的 TME抑制功能[17]。目前关于抗 LAG-3 的临床试验正在进行中。抗 PD-1 治疗无效的黑色素瘤患者在接受抗 PD-1 及 LAG-3 联合治疗后,表现了较好的临床疗效[18]。使用抗 LAG-3 治疗肝癌,可能会有一定治疗效果。

(四)TIM-3 与肝癌免疫及肝癌治疗 T 细胞免疫球蛋白黏蛋白-3(TIM-3)可表达在 CTL、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞以及NK细胞上。在免疫反应中,TIM-3在 Th1 细胞表面作为起抑制作用的分子。TIM-3在黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾透明细胞癌、膀胱上皮细胞癌等多种肿瘤中都有表达。除了上述恶性肿瘤以外,TIM-3对于肝癌的发生发展可能具有重要作用。Li Z等研究171 例乙型肝炎(HBV)相关性 HCC 与 34 例 HBV 相关性肝硬化,通过免疫组化检测肝组织中PD-1 与 TIM-3的表达,结果显示 TIM-3在肿瘤组织中的免疫组化评分(5.06 ± 1.11 )显著高于癌旁组织(3.07± 1.25，P<0.01),及肝硬化组织(1.35±1.18，P<0.01)。此外TIM-3表达还与肝细胞癌的临床分级有显著关系,在 HBV 相关性 HCC 患者中,Ⅲ+Ⅳ级的 HBV 相关 HCC免疫组化染色评分(5.97±0.63)显著高于Ⅰ+Ⅱ级 HBV相关性 HCC患者的免疫组化评分(4.88± 1.18,P<0.01)[19],这些结果提示,TIM-3 对于肝癌发生发展过程中也有重要作用。此外,患者预后与 TIM-3表达程度的显著相关,肝癌细胞高表达TIM-3时,往往提示较差的预后[20]。其可能机制为肿瘤细胞固有的TIM-3能够激活靶细胞 IL-6 的自分泌,然后通过 STAT3 信号通路促进肿瘤生长,从而促进肝癌的进展。研究人员通过在 SMMC-7721 细胞系中引入慢病毒表达颗粒,发现 TIM-3过表达促进上皮间质转换,从而促进肝癌细胞迁移和侵袭[21]。除此之外,抗TIM-3单克隆抗体对小鼠结肠癌和纤维肉瘤模型也有较好的治疗作用。此外,Dardalhon的研究显示了 TIM-3 5D12 在抗 EL4 淋巴瘤治疗中也有较好的疗效[22]。研究还发现阻断TIM-3可以显著增强TIL的增殖以及IFN -γ的分泌,提高杀伤肿瘤效应[23]。在联合抗PD-1与 TIM-3 的临床试验中,其效果优于单独抗 PD-1或 TIM-3[24]。由于制备 TIM-3抗体价格昂贵,学者们重点研究TIM-3的适体,它可以结合在特定分子结构的单链分子 或者是肽链分子上,目前已经获得了具有高亲和力和特异性的TIM-3 核酸酶抗性适体[25]。最新的进展发现其三聚体适体阻断TIM-3和Gal-9的相互作用,从而有效阻断下游信号对肿瘤免疫逃逸的生物学效应。这可能也是肿瘤免疫治疗未来的研究方向之一。

三、展望

综上所述,由于肿瘤微环境免疫调控十分复杂,需要进一步深入研究肝癌发生发展过程中免疫细胞如何有效识别肝癌肿瘤抗原,如何解除肝癌免疫逃逸,增强 T 细胞功能,从而开发出新型免疫治疗的靶向治疗药物,进一步提高肝癌的治疗效果。另一方面，免疫检查点是免疫微环境中重要的效应分子,在肿瘤微环境免疫调节过程中发挥关键作用,可能直接参与肝癌的发生发展,并且可能与肝癌转移过程紧密相关。临床试验也初步表明免疫检查点抑制剂在肝癌治疗中具有一定效果。特别是 PD -1，但其有效率只达到 20%,因此现仍亟须揭示有关 PD-1 甚至其他的免疫检查点更深层的机制,从而开发出了针对肝癌的新的免疫治疗药物,进一步提高肝癌的临床治疗效果。另外将抗 PD-1 抗体联合传统治疗(如化疗，TACE、靶向治疗),或者与针对其他免疫检查点抗体相联合应用,可能将显著提高肝癌患者的治疗效果及生存率，值得深入研究。