基于核磁共振波谱与影像技术分析肝脏的糖脂代谢能力

李纪伟 黎韵诗 刘亚婷 曹誉 赖厚桦 易佩伟 汪艳

近年来，临床肝病诊断方法进展迅速，但肝组织活检目前仍是作为诊断标准的检查方法[1]。不可忽视的是，肝组织活检是创伤性检查，不容易被患者接受，终末期肝病患者存在检查禁忌证，而且这种方法还存在标本取样误差等缺点。因此，研发高效且准确的无创诊断技术一直是临床肝病相关领域关注的热点内容。

糖脂代谢是肝组织的重要生理功能，在已知的许多常见肝病，尤其是脂肪性肝病中，肝组织的糖脂代谢过程(能力)常常出现显著改变，这种变化与肝组织损伤的出现与进展存在密切联系[2]。核磁共振波谱(MRS)和核磁共振影像(MRI)在肝病诊断和肝组织结构功能分析方面显示出了重要应用价值。建立特异性分析肝组织糖脂代谢的NMR方法，从中获得MRS和MRI数据，由此分辨肝组织病理特征，也许可以取代肝活检，帮助实现重要临床肝病的早、中期诊断。

本篇综述引用的文献资料主要来自中国知网、ScienceDirect、PubMed，涉及2003年、2007年、2010至2020年的34篇相关研究，分析了MRS和MRI在肝脏糖、脂代谢方面的主要方法及其优缺点。

一、研究现状

目前，在分析肝组织糖代谢方面，正电子发射断层扫描(PET)取得了较好效果，该技术最常用的代谢底物是葡萄糖类似物2-氟-2-脱氧-d-葡萄糖(18F-FDG)。虽然通过该方法可得到较高分辨率的葡萄糖摄取图像，但无法获知葡萄糖代谢的具体过程，而且18F-FDG具有放射性，限制了重复扫描[3]。与之相比，结合稳定同位素1H、13C和31P的杂核MRS和MRI分析，以及新型的化学交换饱和转移(CEST)成像技术或许能提供一些新思路。

在肝组织脂代谢方面，虽然传统的T1WI、T2WI、扩散加权成像(DWI)等MRI技术可以从宏观角度分析肝组织脂肪分布状态，得出精确至可应用于临床的结果[4-7]，但在微观脂代谢分析方面仍需进一步研究。并且肝脏作为人体最重要的代谢器官之一，拥有复杂的代谢路径，各种物质相互干扰以及当前检测手段的局限性都阻碍了微观脂代谢分析的进一步发展。

二、糖代谢研究进展

(一)杂核MRS与MRI分析

1.超极化13C MRS

相比于MRI常用的1H原子核，13C原子核的旋磁比很小，在自然状态下的丰度比较低，因此一般情况下采集的MR信号的灵敏度非常低。应用动态核极化(DNP)技术(目前被广泛称为超极化)，可提高13C原子核自旋极化能级，进而极大提高13C原子核的检测灵敏度。早在2003年Ardenkjaer-Larsen等的研究就表明，超极化技术可以将13C原子核的能级暂时重新分配到极不稳定的非平衡状态，核磁共振信噪比可增加近10 000倍[8]。但是随着原子核与周围化学环境不断发生相互作用，此种非平衡状态持续时间通常不到60 s。Lumata等研发了溶解性动态核极化(d-DNP)，通过微波将较高极化的电子自旋转移到原子核自旋，从而在系统的塞曼能级上产生较大的自旋分布差异，增强了磁共振的信号。他们还将这种超极化技术与灵敏的超低温探头相结合，获得了目前最高的13C核磁共振灵敏度[9]。

尽管超极化后的13C原子核可以具有很高的检测灵敏度，但是它的极化寿命非常短。例如[1-13C]丙酮酸盐在体内的极化寿命约为30 s，这意味着实验人员必须在注射极化物质后2～3 min内完成成像工作。针对这一问题，Rodrigues等提出降低分子中13C取代度来减小同核偶极驰豫，可以延长其极化寿命[10]。

目前13C MRS已经广泛应用于体内实验检测，能够实时对多种底物及其代谢物进行波谱和影像的定量分析。Khemtong等通过在大鼠心脏中灌注超极化[1-13C]丙酮酸后，原位施加异丙肾上腺素，发现经异丙肾上腺素刺激后，心脏代谢产生了新的超极化[1-13C]乳酸信号，这是由组织中糖原的乳酸含量突然增加引起的[11]。该实验表明超极化丙酮酸和13C MRS可用于无创检测体内组织中的异常糖原代谢。

2.基于2H MRS的氘核代谢成像(DMI)

DMI技术可以在机体代谢过程中对2H原子核所标记的底物进行扫描，并结合2H MRS与三维空间相位编码技术，创建出包含细胞代谢信息的代谢物图像。该技术首次由耶鲁大学De Feyter团队在2018年提出。他们研究证明，利用DMI技术可以区分体内正常和异常代谢组织，检测由于临床治疗引起的葡萄糖代谢变化，该技术应用于肝脏还可以动态测量糖原转换率[3]。他们还绘制了动物模型和人类受试者的大脑和肝脏组织中2H标记的葡萄糖或醋酸盐的代谢图，进一步证明了DMI技术的应用潜力[3]。

DMI的临床应用潜力还体现在只需要很小技术修改以及增设在2H NMR频率(19.6MHz)工作的射频线圈，就能使用3T MRI进行技术操作。但在肝脏中应用时，[6,6'-2H2]葡萄糖和标记的糖原在2H MRS中存在着谱峰重叠的问题。因此需要进一步量化谱峰重叠的程度，或探索改变葡萄糖分子中使用2H标记的结构位点是否可以避免该问题出现[3]。

3.31P MRS

31P MRS技术可以在活体条件下无创地检测出体内的ATP浓度。Gallis等实验证实了，在净糖原合成期间，ATP和糖原的含量呈线性关系[12]。因此可以通过计算线粒体ATP的原位转换速率，测定ATP的变化，来间接反映糖原代谢的变化。化学缺血(氧化磷酸化的抑制)和31P MRS的结合是目前分辨线粒体供应ATP的主要方法。Beauvieux等运用31P MRS技术研究了酒精对线粒体ATP转换和糖原生成之间关系的影响；他们发现与单独葡萄糖比较，酒精和葡萄糖会导致更少的净糖原生成[13]。

总体而言，这种基于31P MRS的方法比较复杂，而且得到的数据也只是间接反映糖原的代谢变化，在检测肝脏糖代谢方面，不如超极化13C MRS和DMI技术应用广泛。

(二)化学交换饱和转移(CEST)成像技术 CEST MRI技术可以通过选择性饱和肝脏组织中特定分子含有的可交换质子，例如酰胺质子、亚氨基质子、氨基质子及羟基质子，将可交换质子的饱和和信号在化学交换过程中转移到本体水分子信号上，通过检测水分子信号的降低来间接获得相应化合物的相关信息[14]。CEST MRI在高特异性显示体内游离的蛋白质、黏多糖GAG、糖原、葡萄糖等一些生化分子方面具有极大优势。van Zijl等最早用化学交换饱和转移成像检测体内糖原，即GlycoCEST实验，他们发现对水质子低场方向0.5～1.5 ppm范围内的羟基质子实施选择性射频(RF)饱和后，可以通过检测选择性饱和后的水信号，来间接获取体内糖原分子的信息[15]，如可以检测给予胰高血糖素灌注后小鼠肝脏的糖原分解。但值得注意的是，体内糖原分子浓度、大小和结构，以及常规半固态组织中的磁化转移效应的不对称性，都会影响到GlycoCEST检测结果[15]。

GlycoCEST在临床MRI扫描仪中的信号比在科学研究专用的超高场MRI扫描仪中的信号要低得多，同时由于临床常用场强下质子的绝对化学位移较小，水信号的直接饱和效应(DS)和羟基共振频率附近的CEST信号可能会影响糖基化信号[16]，因而在临床常用的1.5T和3T MRI扫描仪应用方面，很少有关于体内肝脏GlycoCEST成像结果的报道。最近Deng等首次评估了基于3T MRI进行活体肝脏CEST成像的可行性。他们使用连续矩形脉冲进行预饱和，快速自旋回波(TSE)读出信号，在偏移量(n=41，增量=0.25 ppm)为-5至5 ppm时获取影像，在大鼠进餐前后血糖变化模型测量到了同向变化的GlycoCEST信号[17]。

CEST成像具有空间分辨率较高、无辐射、无需特殊的射频系统、不受探测深度限制等优点，但它也存在一些限制因素，例如CEST成像对磁体场强要求较高，采集信号时间过长导致扫描范围局限，且成像极易受周围环境因素影响，很多活体内代谢物质的饱和频率非常接近而容易引起交叉饱和，这些都会影响CEST成像结果的特异性和准确度[18]。

三、脂代谢研究进展

(一)质子密度脂肪含量(PDFF)的测定 PDFF能够对整个肝脏的脂肪进行准确、无创、可重复的定量评估。它可通过消除T1和T2*弛豫时间、脂肪的复杂频谱特征、MRI信号的噪声偏差、以及MRI系统的不稳定性，计算质子密度脂肪分数。不少研究已证明，其结果与肝活检测定的肝组织脂肪变程度具有高度相关性[19,20]。计算肝脏PDFF关键在于所获得的MR图像中的水-脂肪信息。Bannas等研究发现，可利用温度校正后的脂肪-水重构技术和MRS波谱校准，解决水和脂肪之间与温度相关的共振频率偏移问题，第一次进行PDFF成像后，立即使用高分辨率成像技术重复采样，可评估实验的一致性、可靠性和重复性[20]。Caussy C等研究证明，通过评估并调整控制衰减参数，水-脂肪MRI所得到的PDFF可以达到组织学量化的精度[21]。以上方法均可校正PDFF数据、提升测量精度。

MRS和MRI-PDFF都可以达到组织学测量、活检测定的精度[20,22,23]。但是与MRS在单一体素内精确测量生化信息相比，MRI-PDFF具有更高的空间分辨率，其测量结果可以反映脂肪在肝脏的空间分布，它也可以长期测量脂肪沉积代谢，量化肝脏脂肪在临床试验中的变化。作为一种方便快捷、价格低廉的肝脏脂肪定量技术，MRI-PDFF在实验研究中正逐渐取代MRS技术。为进一步提升其测量精度，改进脂肪信号分析模型是主要研究方向[24]。

(二)标记示踪

1.超极化磁共振

超极化磁共振可以通过体内实时测量化学位移值进行无创的生化反应测量，并通过调整成像参数和增强核极化提供足够的灵敏度，从而获得高空间、高时间分辨率的数据。除了可获得特定的真实信息，该技术还具有分辨不同代谢物的能力，这在一定程度上克服了传统MR成像灵敏度较差的缺点[8,25-27]。在MRI检测中获得的超极化标记化合物的独特信号，可以显示酶的代谢过程、中间产物以及转归形式[28]。根据此特性，研究人员可以标记感兴趣的物质，从微观角度跟踪肝脏脂肪代谢过程。

在生物体内的MRI检测中，代表性的脂代谢底物长链脂肪酸需要与白蛋白结合才能在水中溶解，而此结合会使标记的13C去极化，对检测造成负面影响，但水溶性短链脂肪酸(如丁酸盐类)对其影响则相对较小。丁酸盐快速代谢产生的乙酰乙酸、谷氨酸都适合作为检测标记物[29-30]。乙酰乙酸具有长T1的羰基，结构上适合13C超极化研究，但目前尚未有相关文献报道。极低密度脂蛋白、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白是肝脏脂肪代谢的重要载体分子，但相关研究目前较少。脂肪代谢相关的标记底物及其最佳测量技术参数应作为今后的研发目标。

2.稳定同位素通量/同位素标记代谢通量分析

通量研究的关键步骤之一是根据代谢物的同位素分布，准确地测量代谢物的标记模式。MRS和质谱(MS)是定量同位素的两大主要技术。MRS解析可以提供同位素所富集分子的大小以及在富集分子中的位置等信息。MRS技术具有样品制备简单的优势，但也存在吞吐量小，分析速度较慢，核磁共振信号敏感性低，以及分析通量较低导致成本高等问题，这都阻碍了MRS在生物医学研究中更广泛的应用。相比之下，灵敏度更高和操作更简单的MS分析，已经成为基于稳定同位素标记的代谢相关研究的首选技术。但在许多应用场合中，这两种方法是相辅相成的[31]。

遗憾的是，目前还没有基于稳定同位素通量的方法体系，用于估计线粒体外循环脂肪酸氧化的作用程度。在脂肪性肝病患者肝组织发生氧化应激反应中，线粒体外脂肪酸氧化的作用机制尚未清楚。虽然肝细胞中的微粒体和过氧化物酶体脂肪酸氧化可以在体外模型和动物体内用放射性同位素测定，但这些方法目前还不适用于人体研究。

四、未来展望

以上所介绍的相关方法均在发展进程中，各有优势特点而且个别方法还不够成熟，需要使用临床通用的检测技术，如组织活检、CT、PET、组织学分析等作为参照指标加以对比判断[32-33]。有学者在动物实验的通量研究中使用长链脂肪酸荧光探针实时定位定量脂肪[34]，这提示对肝组织糖脂代谢的分析方法也许还可以在其代谢通路中寻找突破点。基于MRS与MRI分析肝脏糖、脂代谢过程的技术发展未来可期，这可能是通向实现无创诊断肝脏疾病的重要技术方案。更多新型的分析方法或工具以及定量、精细的分析模型的出现，将不断推动核磁共振方法在测量肝组织糖脂代谢中的应用和普及。