骨桥蛋白在慢性肝病发病机制中的作用

杨依娜 朱娅梅 马世武

骨桥蛋白(OPN)于1986年首次报道，是小整合素结合配体N端连接糖蛋白家族的成员，其单词前缀osteo-表示骨骼，后缀-pontin表示桥接，提示OPN在细胞外基质(ECM)中发挥连接蛋白的作用[1]。近年来的很多研究借助OPN基因敲除小鼠(Opn-/-小鼠)和肝细胞过表达OPN的转基因小鼠(OpnHEP Tg)等模型解释OPN在慢性肝病中的作用[2]。

一、OPN的表达与功能

OPN由分泌磷蛋白1(SPP1)基因编码，与小鼠Spp1基因的同源性约为84%，其生理作用与OPN糖基化高度保守的受体结合域、翻译后修饰(PTM)、裂解、聚合和形成五种亚型(OPN-a、-b、-c、-4和-5)等相关[2]。全长SPP1 mRNA翻译产生分泌型OPN(s-OPN)，非AUG密码子下游基因翻译产生细胞内型OPN(i-OPN)。生理状态下，SPP1在人和小鼠的胎盘、肾脏、脑和肝脏中大量表达；在正常肝脏组织中，胆管细胞中SPP1表达较高，其次为巨噬细胞(MFs)、肝细胞、窦状内皮细胞、肝星状细胞(HSCs)、T淋巴细胞和自然杀伤细胞(NK)。OPN表达的调节具有组织特异性，不同细胞类型可有不同的调节机制。OPN受体有整合素和CD44家族，OPN以旁分泌或自分泌方式激活CD44和整合素，诱导PI3K/Akt和有丝分裂原激活的蛋白激酶(MAPK)信号；OPN表达还与β-catenin、NF-κB、MMP2等信号通路相关。OPN具有多种生物学功能，在生物矿化﹑骨重塑﹑细胞介导的免疫应答和伤口愈合等方面中发挥重要作用。人乳中含OPN约138 mg/L，可促进免疫力和器官发育，而富含牛乳OPN的婴儿配方食品的免疫调节作用不弱于母乳。

二、OPN与慢性肝病

(一)肝脏脂肪变性 在酒精性肝病(ALD)和非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)患者和动物模型中，血清和肝脏的OPN水平升高[3-5]。饮酒诱导的OPN可以抑制肝细胞中过氧化物酶体增殖物激活受体α的表达，促进肝脂肪变性；在Opn-/-小鼠中，大量酒精摄入可降低肝甘油三酸酯[3]。相似的，长期摄入酒精的Opn-/-小鼠肝细胞中铁含量增加，促进ALD进展；但肝细胞过表达OPN却能缓解ALD[6]。补充牛奶OPN可以保持肠道完整性和维持肠道细菌平衡，从而预防ALD；OPN可结合LPS，降低TNF-α的产生和氧化应激，从而减少脂肪变性性和ALD[5]。说明不同来源的OPN在ALD中发挥不同作用。

细胞外OPN能促进肥胖和调节脂质合成，从而驱动肝脂肪变性性[4]。在非肥胖NAFLD患者中，血清OPN与肝脏甘油三酯和胆固醇呈正相关；在肥胖患者中，血清OPN与肝脏甘油三酯和胆固醇负相关，说明OPN在脂肪组织和肝脏中诱导脂肪变性性的作用不同[4]。脂肪组织中OPN的增加与MFs聚集有关。在肥胖高脂饮食(HFD)模型中，Opn-/-小鼠或经OPN中和都可降低脂肪组织的炎症和胰岛素抵抗，表明细胞外OPN能引起代谢综合征和脂肪变性性。向野生型(WT)小鼠注射重组OPN可使肝胆固醇含量增加，表明OPN在调节胆汁酸和肝脏脂肪生成中发挥作用。关于OPN在Opn-/-小鼠NAFLD中的作用尚无定论[2]。Opn-/-小鼠喂食HFD后较少发生脂肪变性性；然而，链脲佐菌素诱导的糖尿病Opn-/-小鼠模型在给予HFD后显示肝脏甘油三酯增加。此外，Opn-/-小鼠喂食蛋氨酸缺乏的饮食或含2%胆固醇的HFD对肝脂肪变性性没有影响，却对纤维化有保护作用。

OPN通过抑制自噬和增加肝细胞衰老在非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的进展中发挥作用[2]。来自NASH患者和小鼠的数据显示，OPN在肝细胞浸润的MFs中表达增加。肝细胞来源的OPN可防止ALD中的肝脂肪变性性[5]。

(二)肝脏炎症 从肝硬化和HCC患者肝脏的scRNA-Seq分析中发现，SPP1表达在各种炎性细胞亚群中增加[7-8]。在肝脏炎症中，活化的MFs和Kupffer细胞分泌OPN，其作为旁分泌或自分泌信号通过与α4β1和α9β1整合素结合来刺激MFs迁移。i-OPN通过与CD44-ezrin-radixin-moesin复合物结合来促进MFs迁移，OPN在未成熟树突状细胞中的表达较高，并通过与αvβ3整合素和CD44结合而助其成熟和迁移。T细胞活化后，OPN会增加Th1和Th17细胞的分化。NK细胞的稳态和功能受i-OPN调节，NK细胞中i-OPN的低表达会损害其抗肿瘤反应。OPN可诱导嗜中性粒细胞迁移，促进ALD。

(三)肝纤维化 肝损伤后，肝细胞和炎性细胞可分泌OPN，但HSCs能产生OPN却不能分泌OPN[2]。在乙型和丙型肝炎患者中，血清OPN水平随纤维化分期增加而逐渐增加；在NAFLD相关肝纤维化中，血清OPN水平也升高[9-10]。血清OPN还被看作酒精性肝硬化和NASH所致肝硬化严重程度的生物标志物，且在肝纤维化中起关键作用；它通过TGF-β依赖性机制激活HSCs，并诱导I型胶原纤维沉积。研究还发现，重组OPN可激活原发性造血干细胞，增强其浸润和伤口愈合的可能。从WT小鼠中分离出HSCs比从Opn-/-小鼠中分离出HSCs具有更高的成纤维性，转染负载OPN腺病毒的HSCs可过度表达OPN，增加I型胶原表达。OPN介导的I型胶原诱导是通过αvβ3整合素参与和PI3K-pAkt-NFκB信号通路的激活，而CD44的结合则不参与[11]。注射四氯化碳(CCl4)或饮用硫代乙酰胺导致的急性和慢性肝损伤会提高OPN的表达。过表达OPN的OpnHEP Tg小鼠会发展为自发性肝纤维化。长期注射CCl4和硫代乙酰胺，WT小鼠可造成肝纤维化，Opn-/-小鼠则较少，OpnHEP Tg小鼠则较多[11]。

高迁移率族box-1(HMGB1)是与肝纤维化相关的损伤分子模式，研究发现OPN是在HMGB1上游发挥作用。进展期的慢性丙型肝炎，肝脏OPN表达和HMGB1免疫染色均增强，并与纤维化分期相关；在非进展期的丙型肝炎，则无明显变化。注射CCl4的OpnHEP Tg小鼠中，伴随着HMGB1的诱导可建立良好的肝纤维化模型；在WT小鼠模型中，OPN和HMGB1都较少；而在Opn-/-小鼠中几乎不存在。与能分泌OPN和HMGB1的肝细胞共培养，或者用重组OPN或HMGB1分别进行刺激，可增强HSCs中I型胶原蛋白表达，重组OPN可诱导HSCs中HMGB1乙酰化，导致I型胶原蛋白上调[12]。

(四)肝细胞癌 在HCC中，SPP1 mRNA和OPN蛋白表达增加。研究表明，肝癌细胞可分泌OPN，HCC患者血清OPN升高[13]。OPN被视作HCC的血清生物标志物。在诊断HCC相关的meta分析中，血清OPN的ROC曲线下面积高于甲胎蛋白。此外，OPN还与肝癌患者预后不良相关。研究表明手术切除后患者血清OPN与低总体生存率和无瘤生存率相关，也与HCC高分期、肿瘤大小、血管侵犯相关。在Opn-/-小鼠中，注射二乙基亚硝胺(DEN)后肿瘤表达减少[13]。喂食胆碱缺乏饮食的Opn-/-小鼠HCC模型，肿瘤表达更少，而喂食HFD的链脲佐菌素诱导的Opn-/-小鼠则相反。这些差异可通过OPN的细胞起源或i-OPN与s-OPN的作用解释。

在肝癌细胞系的研究中，重组OPN可诱导肝癌细胞侵袭；OPN过表达会增加肝癌细胞增殖、茎样特性、糖酵解、自噬和对化疗的抵抗力；在具有干细胞特征和成球能力的HCC细胞中，OPN表达上调；而敲除SPP1会降低HCCLM3和HepG2细胞的增殖、迁移和对化疗的敏感性；然而，OPN能抑制甚至阻断HCCLM3细胞的肺转移，提示靶向OPN可能是晚期HCC的治疗方法[14]。在小鼠和人类肝癌中，OPN和PD-L1之间存在相关性，表明OPN参与免疫逃逸[13]。与正常肝组织相比，OPN-a和OPN-b在癌组织中表达增加，在HCC中具有重要作用。

(五)胆道疾病 生理条件下，OPN在胆管上皮细胞中表达，并在肝损伤后被高度诱导[7]。然而，OPN在胆管疾病的发病机理中的作用尚未清楚。与健康对照组相比，胆道闭锁(BA)或胆汁淤积性肝病患者在肝脏中均有SPP1表达，原发性胆汁性胆管炎(PBC)患者的胆管浸润的单核细胞细胞质中观察到OPN的强表达。此外，BA患者血浆中OPN的增加与总胆红素有关，表明其作为BA早期诊断标志物的潜力。使用轮状病毒诱导的BA鼠模型，相较Opn-/-小鼠的生存期较短。大多数表达OPN 细胞产生IgG或IgM抗体，表明OPN可以通过浆细胞扩增触发胆管损伤[2]。在鼠原发性硬化性胆管炎(PSC)模型中，尚未能观察到OPN在发病机制或胆道纤维化中的作用，但也不能完全表明OPN在PSC的发生发展中无关。

寡核苷酸微阵列分析显示，OPN是肝内胆管癌(ICC)患者中表达最多的基因。与邻近肝组织及正常胆管相比，ICC中OPN表达量更高。ICC患者基质中的OPN表达与肿瘤大小和侵袭行为呈正相关。即使在手术切除后，OPN仍是ICC患者预后不良的独立预测因素[15]。OPN激活MEK-MAPK1途径并介导β-连环蛋白的磷酸化，从而激活Wnt信号传导。存在OPN-443(CC)变异的患者有较高的淋巴和远处转移发生率，支持了OPN-443多态性在预测转移中的价值。

虽然OPN明确参与慢性肝病的发病机制，其表达增加与肝脂肪变性、肝脏炎症、肝纤维化、HCC等的发生发展相关，但OPN的表达增加却利于阻断晚期HCC转移，其在不同的肝组织病变中的具体作用机制和诊断价值有待进一步探索。研究OPN在细胞内信号转导途径，探讨OPN是否能作为肝脏疾病的一个治疗靶点，具有其重要价值。