DNA甲基化在乳腺癌中的研究进展*

邓长娟 综述，谢小兵 审校

1.湖南中医药大学，湖南长沙 410001；2.湖南中医药大学第一附属医院医学检验与病理中心，湖南长沙 410000

根据国际癌症研究机构(IARC)在2020年发布的数据,全球乳腺癌新发病例预计高达226万例，其死亡病例数约为68万，排名第五，但在女性中排名第一，同时乳腺癌也是中国女性最常见的癌症，中国2020年的新发病例数预计为42万，占全世界的18.6%，死亡约为12万，占全世界的17.6%[1]。乳腺癌的发病原因较多，如饮食习惯、生活方式的改变、肥胖、生殖因素和长期的内源性雌激素接触(初潮早、绝经晚、未产妇或高龄首次次足月妊娠)等是女性乳腺癌的重要危险因素[2-4]。同时，研究表明，乳腺癌的发生与表观遗传改变密切相关[5]。表观遗传学即DNA的碱基排列不变，但是由于某些原因使基因的表达出现了可以遗传的变化。一般认为表观遗传学包括DNA、RNA和组蛋白的修饰及染色质三维结构改变等，现在发现至少有4种DNA和16种组蛋白修饰，其中对DNA甲基化的研究最深[6]。DNA甲基化描述了DNA甲基化转移酶(DNMT)将S-腺苷甲硫氨酸(SAM)上的一个甲基与胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤二核苷酸(CpG)上胞嘧啶残基第5位碳原子结合，生成5′-甲基胞嘧啶(5mC)的过程[7]。目前有5种与真核生物相关的DNMTs，分别为DNMT1、DNMT2、DNMT3L、DNMT3a、DNMT3b[8]。本文综述DNA甲基化在乳腺癌发生、发展中的分子机制及在早期筛查、预后和靶点治疗等方面的研究进展，并对未来的研究提出建议和展望。

1 DNA甲基化与肿瘤

在人体中，CpG含量较低，而在启动子和第一外显子区域，富集CpG位点，这个富集CpG位点的区域被称为CpG岛(CGI)[9]。当抑癌基因CGI过度甲基化时，DNA的转录过程被抑制，造成恶性肿瘤的发生，DNA甲基化可以沉默各种不同类型的基因。同时，致癌基因反常低甲基化也与恶性肿瘤密切相关[10]。启动子区域的低甲基化使基因处于异常活跃状态，产生一些异常蛋白质，破坏正常细胞结构，使细胞的功能紊乱并由此引发癌症[11]。GGI的甲基化过高或过低与癌症的发生关系密切，而全基因组低甲基化也与癌症的发生关系密切。MOORE等[12]研究发现，白细胞基因组DNA低甲基化会增大膀胱癌风险，全基因组DNA低甲基化会引起染色体不稳定并导致癌症发生，此后又有学者发现，在中国血液白细胞DNA的特异性核基质蛋白-4(BLCA-4)重复序列中检测到总体甲基化不足的个体患乳腺癌的风险增加，并且表明BLCA-4低甲基化可能是乳腺癌患者预后不良的有用生物标志物[13]。

2 DNA甲基化与乳腺癌

基因启动子甲基化在乳腺癌中非常普遍，超过100个基因启动子被报道有高甲基化现象[14]，包括(1)细胞周期调控基因，如细胞周期蛋白D2基因(CCND2)和细胞周期依赖性激酶抑制基因(CDKN2A)[15-16]；(2)DNA修复基因，如乳腺癌易感基因1(BRCA1)、乳腺癌易感基因2(BRCA2)[17-18]、胱甘肽S转移酶P1基因(GSTP1)[19]；(3)组织侵袭和转移基因，如Ras相关区域家族1A基因(RASSF1A)[20]、视黄醇受体β基因(RARβ)[21]；(4)细胞转录基因，如同源框基因A基因(HOXA1、HOXA5、HOXA9、HOXA10等)[22-23]；(5)细胞黏附基因，如钙黏着蛋白1基因(CDH1)[24]；(6)激素介导的细胞信号传导基因，如雌激素受体α基因(ERα)[25]。原癌基因启动子低甲基化也会导致癌症发生，如三叶因子1基因(TFF1)[26]，这表明基因甲基化在乳腺癌生长和转移中发挥重要作用。

3 DNA甲基化在乳腺癌早期筛查中的作用

目前，大多数乳腺癌患者在确诊时就已经是晚期或者转移阶段[27]，因此，癌症早期筛查标志物意义重大。乳腺癌的辅助检查手段主要有体格检查、超声检查、钼靶检查、核磁共振检查。超声和钼靶检查具有假阳性高、射线暴露、疼痛、焦虑和负面心理等缺点[28]，假阳性会导致对乳腺癌的过度诊疗[29]，而核磁共振检查价格昂贵。因此，寻找新的足够灵敏和特异的经济型癌症筛查预后生物标志物意义重大。

DNA甲基化修饰参与癌症早期过程，并且随着癌症进展，其DNA甲基化出现了不同模式。近年来大量文献研究了循环或无细胞 DNA(cfDNA)甲基化状态在包括乳腺癌在内的各种肿瘤诊断与预后中的作用[30-34]，cfDNA检测具有采集方便、无创、可重复的优点，在检测诊断中具有广阔前景。有研究指出，在三阴性乳腺癌中，BRCA1启动子在cfDNA和组织标本中的甲基化水平差异无统计学意义[18]，在乳腺癌患者外周血中，APC、FOXA1、RASSF1A、BRCA1、ATM等基因启动子甲基化频率相对于健康者更高[31,35-39]。因此，cfDNA作为生物标志物在癌症检测中具有广阔的应用前景。

但是cfDNA在外周血与正常细胞DNA中同时存在，这会导致特异度降低；cfDNA在健康者外周血中的水平为5～20 ng/mL,并且通过检测母体中胎儿游离DNA发现其半衰期平均为16.3 min，这些都导致cfDNA作为生物标志物灵敏度降低。但是联合检测多种特异性cfDNA可以提高检测灵敏度与特异度。

4 DNA甲基化在乳腺癌预后中的作用

DNA甲基化除了在乳腺癌早期筛查中发挥作用外，还与患者不良预后密切相关。研究人员发现类成对同源框转录因子2基因(PITX2)的甲基化使乳腺癌不良预后风险增大[40]；MEHROTRA等[41]研究发现，与乳腺癌远处转移相关的基因CCD2、RAR-β、Twist、RASSF1A和HIN-1甲基化频率在转移性乳腺癌组织标本中较原发性乳腺癌高；并且研究表明乳腺癌患者甲基化水平与生存时间密切相关[42-43]。

5 DNA甲基化转移酶抑制剂(DNMTi)与乳腺癌治疗

DNA甲基化的变化是一种动态且可逆转的过程，DNA去甲基化造成转录激活，重新表达沉默基因，这为癌症提供了一种新思路。DNMTi下调基因甲基化水平，使由于高甲基化而沉默的基因重新表达以达到治疗癌症的目的。

目前，DNMTi主要用于治疗骨髓异常增生综合征(MDS)等血液系统恶性肿瘤，而在实体瘤中的临床应用还在研究当中。美国食品药品管理局(FDA)已批准地西他滨(5-氮杂胞嘧啶核苷)等DNMTi药物用于临床治疗所有亚型的MDS。DNMTi能显著改善患者生活质量，提高预期寿命[44-45],且DNMTi与组蛋白脱乙酰基酶抑制剂(HDACi)联合用药具有协同作用，治疗效果更好[46-48]。

DNMTi单独或联合其他抗肿瘤药物在细胞实验和动物实验中的效果明显，如地西他滨联合经典抗肿瘤药物聚ADP核糖聚合酶抑制剂(PARPi)对具有野生型或突变型BRCA甲基化导致的乳腺癌和卵巢癌有治疗效果[49]，地西他滨可以反转乳腺癌中蛋白激酶D1(PRKD1)启动子甲基化，恢复PRKD1的表达并阻断肿瘤向肺的扩散和转移[50]。但是一项关于用于地西他滨联合HDACi(恩替司他)用于治疗晚期乳腺癌临床试验未能达到预期效果的研究表明，DNMT抑制剂在乳腺癌中的临床治疗效果尚待研究，同时DNMTi治疗乳腺癌的最佳剂量和方案尚未得到充分研究[51]。

6 DNA甲基化常见的检测方法

6.1限制性酶切PCR法(RE-PCR) RE-PCR是最早的DNA甲基化检测技术。其基本原理为：使用两种专门的限制内切酶处理DNA后，这两种酶分别对甲基化灵敏和不灵敏。根据甲基化片段上下游的碱基排列来确定引物的PCR扩增。DNA有甲基化现象，则含有甲基化位点的这段基因将被扩增，否则无法扩增。RE-PCR操作简单，成本低，但这个方法需要大样本检测且只能检测限制性内切酶识别的CpG岛甲基化状态，当酶切不完全时易出现假阳性。

6.2甲基化特异性PCR法(MSP) MSP是经典的甲基化检测方法，亚硫酸氢钠处理DNA后，未甲基化DNA序列中的胞嘧啶变成尿嘧啶，而甲基胞嘧啶不改变。按照两种碱基序列，分别设计甲基化引物和非甲基化引物进行PCR扩增，凝胶电泳检测扩增片段确认基因是否发生甲基化。该方法操作简单、费用较低且特异度较高，但只能对已知甲基化位点的序列进行检测，并且不能定量分析甲基化水平。

6.3重亚硫酸盐测序法(BSP) BSP同样先用亚硫酸氢钠预处理DNA，接着设计两种引物进行PCR，再经过克隆、测序等步骤可以得知DNA序列中单独CpG位点是否发生了甲基化。该方法特异度和灵敏度都很高，但是操作复杂，成本也较高。

6.4甲基化敏感性高分辨率熔解曲线法(MS-HRM) 高分辨率熔解法(HRM)最初是用来检测单核苷酸多态性基因分型的，后被完善用于DNA甲基化检测。其同样经亚硫酸氢盐处理，PCP扩增得到两种产物。根据两种产物熔解曲线不同并以此检测DNA甲基化水平。MS-HRM操作较简单，灵敏度高且成本较低，但是只能用来检测DNA总体甲基化水平，无法检测单个CpG位点甲基化状态。

6.5甲基化荧光检测法 甲基化荧光检测法是高通量检测，该方法同样先用亚硫酸氢钠处理DNA,接着设计引物和TaqMan 荧光探针来进行PCR扩增，根据获得的荧光信号得知DNA甲基化状态。甲基化荧光检测法具有灵敏度高的特点，能够在超过10 000倍未甲基化等位基因的情况下检测甲基化等位基因。甲基化荧光检测法过程比较简单、定量准确、特异度高，能够快速筛查肿瘤，但同时检测成本也较高。

6.6焦磷酸测序法 焦磷酸测序法是DNA甲基化检测结果的“金标准”，是第3代测序技术。同样先用亚硫酸氢钠处理DNA，随后进行焦磷酸测序，最后进行甲基化分析。焦磷酸测序能够定量精确到单个位点。

7 小 结

近年来大量研究均证实，DNA甲基化与乳腺癌的发生、发展、预后等密切相关，DNA甲基化是一个具有广阔应用前景的研究方向。cfDNA甲基化改变作为筛查手段,能够对传统乳腺癌筛查起到补充或者改进的作用，并且多项研究表明，联合多种特异性甲基化指标能提高乳腺癌诊断的特异度和灵敏度。此外，肿瘤或邻近组织或外周血中的DNA甲基化改变也可以帮助临床医生确定乳腺癌的预后和疗效。同时DNMTi在MDS中的成功应用也为乳腺癌治疗开拓了新思路，并且已有动物和细胞实验表明DNMTi与其他抗肿瘤药物联合使用能得到更好的疗效。但是，DNMTi在乳腺癌中的临床应用还需要广大研究人员不断深入研究。甲基化检测的方法随着测序技术的发展也越来越先进，极大地推进了甲基化研究进展。总之，DNA甲基化作为乳腺癌生物标志物的临床应用及实现临床治疗还需要进一步的研究。