血流感染中头孢吡肟异质性耐药大肠埃希菌的流行病学分析*

吴 瑕，何建春，赵峻英，冯 娅

重庆市大足区人民医院检验科，重庆 402360

大肠埃希菌是一种常见的条件致病菌，在某些条件下容易引起血流感染，最终导致脓毒症或其他并发症，严重威胁患者生命安全[1]。然而，近年来由于临床不合理用药或经验用药导致高比例耐第3代头孢菌素菌株不断增加，甚至出现了一定比例耐头孢吡肟菌株[2]，给临床抗感染治疗带来极大困扰。笔者团队在进行K-B法复核头孢吡肟药敏时，发现其抑菌圈内有大小不等的菌落生长，通过文献得知其为异质性耐药[3]，并且异质性耐药菌株通常是细菌从敏感进化到耐药过程的中间阶段菌株，如果不通过常规的K-B法，很难发现该类型的菌株[4]。因此，该类型的菌株将比敏感菌株更快进化成耐药菌株。本研究对头孢菌素类抗菌药物产生异质性耐药的大肠埃希菌进行研究，并通过双病例对照研究调查分析本院2015年1月至2018年12月血流感染中异质性耐药大肠埃希菌的流行病学情况，为指导临床合理用药从而预防和控制该类菌株甚至耐药菌株的出现提供依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 回顾性收集本院2015年1月至2018年12月血流感染中分离的248株大肠埃希菌，去除同一患者反复培养阳性的重复菌株。根据大肠埃希菌对头孢吡肟药敏情况分为头孢吡肟耐药组、头孢吡肟异质性耐药组、头孢吡肟敏感组。

1.2方法

1.2.1菌株鉴定、药敏情况及超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)确证 所选标本均为血液标本，并依据《全国临床检验操作规程》第4版[5]进行细菌的分离和培养，然后采用Vitek 2 Compact全自动细菌鉴定系统进行细菌鉴定，采用其配套药敏卡分析细菌对各类抗菌药物的最小抑菌浓度(MIC)，即药敏试验。最后，依据美国临床实验室标准化委员会(CLSI)标准判读结果。ESBLs检测及确证：依据CLSI，采用双纸片协同试验进行确证。

1.2.2K-B法 在血平板上复苏248株大肠埃希菌，并根据《全国临床检验操作规程》第4版[5]进行K-B法标准操作，贴上头孢吡肟药敏纸片，于35 ℃孵育24～48 h后，测量其抑菌圈直径，若观察到抑菌圈内有菌落生长则初步判断为异质性耐药。相反，则为敏感、中介或耐药。

1.2.3菌落谱型分析(PAP)实验 该实验是判定异质性耐药现象的“金标准”[3]。异质性耐药判断标准：细菌在抗菌药物最高非抑菌浓度到最低完全抑菌浓度之间的比值≥8倍[3]。将K-B法初筛为异质性耐药的菌株进一步通过PAP实验进行确证，PAP实验步骤参考文献[6]，主要步骤为：配制梯度头孢吡肟抗菌药物，制备梯度头孢吡肟抗菌药物平板，细菌均匀涂布头孢吡肟抗菌药物平板并孵育，每次实验重复3次再计数，并进行换算和作图。将大肠埃希菌标准菌株ATCC25922作为质控菌株。

1.2.4脉冲场凝胶电泳(PFGE) 该方法主要用于细菌同源性分型，是判定临床菌株间是否发生同源性暴发最重要的方法。选择MIC相同或相近的异质性耐药菌株共20株，通过相关文献报道的PFGE方法完成该实验[7]，最后再通过PFGE条带分析这些临床菌株间的同源性。

1.2.5相关耐药基因的检测 选择头孢吡肟异质性耐药组的菌株为研究对象，进行相关耐药基因检测。首先,提取细菌的DNA，然后通过PCR法检测其可能存在的相关耐药基因，包括blaCTX-M、blaTEM、blaSHV、blaOmpF和blaOmpC等，其所需引物参考文献[7]设计。

1.2.6相关危险因素分析 采用双病例对照研究，通过本院临床病历系统和检验科医院管理系统收集248例感染大肠埃希菌患者的相关资料，包括患者基本情况、基础疾病、并发症、侵入性操作、先前抗菌药物使用和患者转归等。

1.3统计学处理 采用SPSS22.0软件进行统计学分析。计数资料以率表示，采用χ2检验，采用多因素Logistic回归(逐步前进法)进行因素分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1菌株头孢吡肟异质性耐药率及临床分布特征 在248株菌株中，K-B法复核后发现，在K-B法抑菌圈内有菌落生长的菌株共78株，并将其初步判定为异质性耐药菌株，见图1。然后再将这些菌株通过PAP实验进行确认，发现其均为异质性耐药菌株。药敏分析结果显示，在248株菌株中，对头孢吡肟异质性耐药的菌株有78株(占31.5%)，对头孢吡肟耐药的菌株有63株(占25.4%)，对头孢吡肟敏感的菌株有107株(占43.1%)。从科室分布来看，头孢吡肟异质性耐药大肠埃希菌主要来自外科(146株，占58.9%)，主要集中在泌尿外科(38株，占26.0%)、ICU(28株，占19.2%)和感染科(18株，占12.3%)。

2.2头孢吡肟异质性耐药大肠埃希菌的PFGE分型 通过对比分析20株头孢吡肟异质性耐药大肠埃希菌的PFGE条带，结果未发现有相同或相似PFGE条带，表明这些菌株间型别及来源不同，不存在同源性传播，见图2。

2.3头孢吡肟异质性耐药菌株耐药基因的检测 通过对78株头孢吡肟异质性耐药大肠埃希菌的耐药基因进行检测，结果发现所有异质性耐药菌株均含blaOmpF和blaOmpC。在所有异质性耐药菌株中，有32株为产ESBLs菌株，PCR检测结果显示，有23株表达blaCTX-M(占71.9%)，9株表达blaTEM(占28.1%)，仅3株表达blaSHV(占9.4%)，有2株同时表达blaCTX-M和blaTEM(占6.2%)，有1株同时表达blaCTX-M和blaSHV(占3.1%)。

注：A表示对头孢吡肟敏感；B表示对头孢吡肟异质性耐药；C表示对头孢吡肟耐药。

注：1～20为20株异质性耐药菌株的对应编号。

2.4危险因素分析

2.4.1单因素分析 头孢吡肟耐药组与头孢吡肟敏感组比较，年龄>60岁、入住ICU、尿路感染、低蛋白血症、导尿管、头孢菌素类和产ESBLs差异有统计学意义(P<0.05)；临床转归显示，总住院>30 d差异有统计学意义(P<0.05)。头孢吡肟耐药组与头孢吡肟异质性耐药组比较，转院患者、尿路感染、头孢菌素类和产ESBLs差异有统计学意义(P<0.05)。头孢吡肟异质性耐药组与头孢吡肟敏感组比较，转院患者、灌肠、头孢菌素类和产ESBLs差异有统计学意义(P<0.05)；临床转归显示，患者病死率差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.4.2多因素分析 进一步将上述单因素分析中差异有统计学意义的变量采用多因素Logistic回归分析结果显示，头孢吡肟耐药组与头孢吡肟敏感组比较，年龄>60岁、尿路感染、导尿管、头孢菌素类和产ESBLs是头孢吡肟耐药大肠埃希菌的独立危险因素；头孢吡肟耐药组与头孢吡肟异质性耐药组比较，尿路感染和产ESBLs是头孢吡肟耐药大肠埃希菌的独立危险因素；头孢吡肟异质性耐药组与头孢吡肟敏感组比较,转院、粒细胞减少症、灌肠和产ESBLs是头孢吡肟异质性耐药大肠埃希菌的独立危险因素。见表2。

表1 头孢吡肟敏感、耐药和异质性耐药大肠埃希菌的单因素分析[n(%)]

续表1 头孢吡肟敏感、耐药和异质性耐药大肠埃希菌的单因素分析[n(%)]

表2 头孢吡肟敏感、耐药和异质性耐药大肠埃希菌的Logistic回归分析

3 讨 论

大肠埃希菌是一种常见的条件致病菌，易引起血流感染等导致患者死亡，临床常采用头孢菌素等抗菌药物进行治疗，导致出现越来越多的产ESBLs大肠埃希菌，头孢吡肟是一种常见的用于抗感染治疗的β-内酰胺类抗菌药物，也作为治疗该类菌感染的一个重要选择，但近年来呈现耐药率逐渐增高的趋势[8]，导致临床有时治疗效果不佳或治疗失败。本研究结果发现，血流感染患者分离出的大肠埃希菌除对头孢吡肟耐药外，从相当比例病情恶化的患者分离的大肠埃希菌对头孢吡肟产生了异质性耐药现象，临床常误认为对头孢吡肟敏感，而导致治疗失败。

从药敏结果来看，本院大肠埃希菌对头孢吡肟的耐药率为25.4%，略低于2018年中国细菌耐药监测网(CHINET)的监测数据[9],CHINET显示，大肠埃希菌对头孢吡肟的耐药率为27.3%，但也低于本院大肠埃希菌对头孢吡肟的异质性耐药率(31.5%)，说明头孢吡肟异质性耐药现象存在且需要临床特别注意，以防临床治疗失败而无法找出其中的原因。从科室分布来看，头孢吡肟异质性耐药大肠埃希菌主要来自外科，并以泌尿外科和ICU检出率最高，可能原因为泌尿外科患者经常进行尿路插管等操作损伤尿道而引起细菌上行感染入血，ICU患者常有非常严重的病情，加上各类抗菌药物的不合理使用，使得敏感菌被杀灭而未被杀死的耐药亚群菌引起血流感染，所以应加强对这些科室耐药菌株的监测和防控[10]。从头孢吡肟异质性耐药菌株同源性来看，异质性耐药菌株PFGE条带不一，说明头孢吡肟异质性耐药菌株不是由于菌株间同源性传播引起的。从耐药基因检测结果来看，异质性耐药菌株主要表达blaCTX-M基因，与相关报道CTX-M型是目前我国最主要产ESBLs基因型结果相一致[11]，其次为TEM基因型。

进一步通过双病例对照研究进行相关危险因素分析，结果显示，在头孢吡肟耐药组、头孢吡肟异质性耐药组和头孢吡肟敏感组两两比较中，既存在各自不同的独立危险因素，也存在其共同的独立危险因素。首先，分析上述两两比较中的各自不同的独立危险因素，从头孢吡肟耐药组与头孢吡肟敏感组比较来看，尿路感染和导尿管是头孢吡肟耐药大肠埃希菌的独立危险因素。尿路感染最常见的是大肠埃希菌感染，加上人为通过侵入性操作如导尿管入侵泌尿道引起尿路感染的细菌定居和繁殖，当抗菌药物作用于敏感细菌，而这些菌株隐蔽于导尿管等位置躲过抗菌药物的作用或剂量不足，使得敏感菌株逐步变成耐药菌株，再加上住院患者本来免疫力低下，使得引起尿路感染的细菌特别是耐药菌就有机会入血液而引起耐药菌血流感染，导致治疗失败[12]。这也与本研究发现的耐药菌株主要来自泌尿外科相一致。另外，头孢菌素类抗菌药物的使用也是头孢吡肟耐药大肠埃希菌的独立危险因素，并且在头孢吡肟耐药组有更高的头孢菌素类抗菌药物使用比例(46.0%vs. 16.8%)，说明头孢菌素类抗菌药物常用于临床抗感染治疗。长期高频率使用该类抗菌药物使得细菌在抗菌药物的压力下为了生存而发生基因突变，或产生耐药基因，导致细菌耐药特性发生变化，甚至导致患者体内菌群失调，使临床治疗更加棘手[13]。临床转归显示，患者病死率比较差异无统计学意义，说明患者发生头孢吡肟耐药后，临床可能直接使用碳青霉烯类抗菌药物，使得患者病情好转。从头孢吡肟耐药组与头孢吡肟异质性耐药组比较来看，尿路感染是头孢吡肟耐药大肠埃希菌的独立危险因素。异质性耐药常直接被临床或微生物工作者作为敏感菌株处理，因而其发生原因可能与上述一致。从头孢吡肟异质性耐药组与头孢吡肟敏感组比较来看，转院是头孢吡肟异质性耐药大肠埃希菌的独立危险因素，其发生原因可能为很多患者在转入本院前在其他更低一级医院进行了相关不合理的治疗，如滥用抗菌药物或使用的抗菌药物不对、不足等，导致异质性耐药菌株的出现，在转入本院时已经携带。另外，灌肠也是头孢吡肟异质性耐药大肠埃希菌的独立危险因素，其原因可能是住院患者长期使用抗菌药物，一部分抗菌药物进入肠道逐步作用于大肠埃希菌，使得敏感大肠埃希菌在剂量不足的抗菌药物压力下变成异质性耐药菌株，当患者进行灌肠时，患者肠道黏膜受损，异质性耐药菌株乘机入血[14]。临床转归显示，患者病死率比较差异有统计学意义，异质性耐药菌株常常被误认为是敏感菌株，未引起临床注意，导致治疗失败。因此，通过常规的K-B法进行异质性耐药的筛选显得格外重要。

最后，分析上述两两比较中的共同独立危险因素，结果显示，产ESBLs是头孢吡肟耐药和异质性耐药大肠埃希菌的共同独立危险因素，其可能原因为头孢吡肟是一种β-内酰胺类抗菌药物，ESBLs又是一种能够水解β-内酰胺类抗菌药物最常见的酶，故而产ESBLs也是一种天然的耐头孢菌素类抗菌药物酶，因此，应加强对ESBLs的监测，对产ESBLs菌株的治疗可以选择其他种类抗菌药物或活性更高的碳青霉烯类抗菌药物进行治疗，以减少异质性耐药菌的出现。

综上所述，本院头孢吡肟异质性耐药大肠埃希菌比例较高，随着临床抗菌药物(特别是头孢菌素类)的不合理应用，产ESBLs菌株的不断出现，加上临床对异质性耐药的关注度不够，使得头孢吡肟的异质性耐药和耐药率逐年升高，给临床治疗带来了困难。因此，临床可以根据患者流行病学危险因素并结合患者的病情，采取适当的防治措施，以减少头孢吡肟耐药和异质性耐药大肠埃希菌的流行。本研究的不足之处在于未对异质性耐药的发生机制进行深入研究。