从HBV X蛋白的生物学功能看靶向HBx临床治愈慢性乙型肝炎的可能性

许梓萌 李德瑶 席婧媛 鲁凤民

乙型肝炎病毒(HBV)属嗜肝DNA病毒，由其引起的慢性HBV感染是慢性乙型肝炎(CHB)的重要病因。据统计2015年全球仍有约2.57亿慢性HBV 感染者，每年约88.7万人死于慢性HBV感染所致的肝硬化、肝功能衰竭和肝细胞癌(HCC)[1]。CHB的临床治愈面临巨大挑战。CHB难以治愈与其独特的病毒复制过程及感染肝细胞广泛存在HBV基因组DNA片段整合有关[2-3]。HBV基因组有两种不同形式，其一为长约3.2 kb的松弛环状不完全双链DNA(rcDNA)，主要存在于具有感染性的、带有包膜的完整病毒颗粒(Dane颗粒)和裸核衣壳内；其二为以游离的微小染色体形式存在于感染肝细胞核内的共价闭合环状DNA(cccDNA)。除此之外，HBV DNA还以亚基因组片段广泛整合到肝细胞染色体DNA上。这种整合与肝癌的发生密切相关，但其对HBV复制的生物学意义尚不清楚。近期的研究显示，对于长期接受核苷(酸)类药物(NAs)抗病毒治疗的CHB患者及HBeAg阴性患者，整合HBV DNA片段可能是其血清HBsAg的主要来源[4]。以微小染色体形式存在于感染肝细胞细胞核内的cccDNA是产生和维持病毒慢性感染主要原因[5]。由于NAs 仅通过抑制HBV逆转录和子代病毒DNA产生，其对cccDNA并无直接作用，在血清HBV DNA检测不到的情况下，NAs治疗的患者肝组织内cccDNA可能仍在转录和表达病毒蛋白，并导致停药后复发[6]。近期研究发现，作为病毒共转录调控蛋白，HBx在cccDNA的转录激活和维持以及HBV相关肝细胞癌的发生、发展中发挥重要作用[7-8]。因此，以靶向HBx蛋白的CHB治疗成为新的研究热点[9-10]。本文主要介绍HBx在HBV复制中的作用，并简述靶向HBx药物的研究进展。

一、HBx的结构及来源

已知的嗜肝DNA病毒属由人HBV，鸭乙型肝炎病毒(DHBV)、土拨鼠肝炎病毒(WHV)等组成。上述病毒的基因组构成在不同种属间高度保守，DHBV缺乏表达HBx的开放阅读框架，也不表达HBx蛋白。人HBx蛋白含154个氨基酸，由具有负调控作用的氨基末端结构域和反式激活或共激活作用的羧基末端结构域组成，存在于感染肝细胞的细胞质和细胞核中[11]。由于既往对HBV病毒学特征的了解多来自于DHBV模型，因此在很长一段时间内，人们对HBx的功能知之甚少。直到2009年Belloni等[12]发现HBx可结合并调节cccDNA微染色体的表观遗传修饰，进而调节其转录，人们才重新开始关注HBx蛋白。2011年，Lucifora等[7]对人HBV感染早期事件的细致分析揭示，尽管带有HBx表达缺失突变的rcDNA能入核并形成cccDNA，但该cccDNA往往缺乏转录活性，不能建立有效感染。该研究还证实，对于已建立感染的cccDNA，其转录活性的维持仍然需要HBx蛋白存在。除此之外，HBx还可激活肝细胞内的多种信号通路，分别对HBV复制产生不同影响[13-14]。以上研究充分说明HBx蛋白在HBV有效感染建立和感染病毒持续复制的维持中都发挥重要作用。

传统认为，HBx蛋白由0.7 kb的X转录本翻译而来。但后期的研究发现，除了经典的5种HBV RNA外，在感染肝细胞内还存在3.9 kb的超长转录本，我们实验室近期的一项对HBV 转录本的长测序结果也证实了这一点[15]。有研究发现，在HBV感染早期，0.7 kb HBx mRNA虽然存在，但随着感染的建立很快消失，而3.9 kb mRNA在感染过程中持续存在[16]。我们近期的体外转录组学全长测序证实，3.9 kb 转录本在丰度上远远高于0.7 kb HBx mRNA[15]。由于3.9 kb mRNA上存在完整的HBx编码读框，人们推测该3.9 kb的超长转录本可能翻译HBx。通过转染3.9 kb mRNA表达质粒检测HBx的表达，Gilad Doitsh等[16]发现3.9 kb mRNA的确能够表达HBx，但其自身出核相对较慢。

二、HBx促进和维持HBV cccDNA活跃转录的分子机制

HBV基因组较小，携带的遗传信息有限，需通过与宿主细胞内蛋白相互作用以促进其复制。HBx是HBV产生的主要调节蛋白，可与多种细胞因子、转录相关酶相互作用，促进cccDNA转录或解除宿主因子对cccDNA转录的抑制[17]。

(一)HBx调节cccDNA结合组蛋白的化学修饰 HBV cccDNA与组蛋白、非组蛋白结合形成微小染色体，以附加体(episome)的形式存在于细胞核中。并且与宿主细胞染色质结构相似，cccDNA也可以被宿主表观遗传相关蛋白修饰，其转录活性和宿主染色质一样受染色质结构和修饰的影响。在感染肝细胞核内，与HBV cccDNA启动子结合的组蛋白H3被低乙酰化和甲基化，异染色质蛋白募集，从而使cccDNA转录被抑制。而HBx则可将CREB结合蛋白(CBP)、p300和p300/CBP相关因子等组蛋白乙酰转移酶募集到cccDNA上，促进组蛋白乙酰化以维持cccDNA的活跃转录[12]。HBx还能够将赖氨酸特异性去甲基酶-1(Lysine-specific demethylase-1，LSD1)和赖氨酸甲基转移酶Set1A招募到病毒启动子上，两者分别通过抑制H3K9me2去甲基化和积聚激活H3K4me3来激活病毒转录[18]。除此之外，HBx还能够抑制SETDB1介导的H3K9me3修饰和异染色质蛋白HP1在染色质上的蓄积，从而消除H3K9me3和HP1导致的cccDNA转录沉默，使致密超螺旋的非活性染色质转换为活性状态[19]。

(二)HBx促进SMC5/6的降解 真核细胞内的染色体结构维持复合物5/6(SMC5/6)对链状DNA具有亲和力，并以ATP依赖方式的使其固缩，降低DNA的转录活性。由于cccDNA与宿主双链DNA结构相似，SMC5/6作为宿主限制因子也能够抑制cccDNA的转录[20-21]。HBx蛋白通过与宿主DNA损伤结合蛋白1(Damage specific DNA binding protein 1，DDB1)，并通过后者招募SMC5/6并使之泛素化降解，从而解除SMC5/6对cccDNA转录的抑制作用[22-23]。

(三)HBx与 YY1等的空间互作介导cccDNA转录激活 细胞核作为一个空间，同一染色体内和不同染色体间的远距离相互作用已被证明能使广泛分离的功能性DNA元件在空间上紧密接近，并在这些元件之间产生相互作用。染色体元件之间的相互作用往往需要一种或多种细胞蛋白质参与，如转录因子CTCF、黏连蛋白和阴阳1(YY1)。YY1是一种细胞内普遍存在的转录因子，通过其锌指基序识别特定的DNA序列并与之结合，发挥转录调控作用，在细胞发育、分化、增殖和凋亡中起作用。人染色体19p13.11区域包含一个强活性的增强子元件(http://genome.ucsc.edu)，我们近期的一项研究发现，YY1蛋白介导了19p13.11增强子与HBV cccDNA之间的空间相互作用，并在病毒蛋白HBx的协调作用下使cccDNA转录激活[24]。这与我国张鹏远等[25]有关HBV cccDNA与宿主染色体上的高活性转录位点的报道相契合。近期，来自李文辉实验室的另外一项研究对HBx缺失的cccDNA肝细胞核染色质定位，也发现转录静默的cccDNA在空间上存在于19号染色体上与19p13.11增强子区域相毗邻的转录静默区域[26]。总而言之，这些研究为cccDNA微染色体通过与细胞染色体的空间相互作用调控其自身转录和HBV复制提供了实验证据。

三、整合来源的HBx截短体及其在HBV相关疾病中的作用

关于HBV整合的研究发现，除cccDNA外，整合的HBV基因组也可能表达羧基端截短的、融合未知氨基酸序列的HBx蛋白[27]。整合的HBV基因组通常具有HBx启动子(XP)，能够起始HBx mRNA的转录，但不具有polyA信号位点，因此转录本可以越过HBV-宿主基因连接部分，借由宿主基因上的polyA信号终止。融合转录本上的融合HBx ORF终止密码子往往并非HBx本身的终止密码子，而是宿主序列上的终止密码子[28]。HBx的羧基端区域对于HBx蛋白的线粒体定位不可或缺，该结构域参与了多种细胞质信号转导途径的激活，因此，羧基端截短的HBx蛋白调控细胞增殖和转录活性的能力可能有所改变[28-29]。有研究发现与全长HBx相比，羧基端截短的HBx在HBV相关的HCC中表达更高，提示截短的HBx在HCC发生、发展中可能发挥更重要的作用[30]。HBx截短蛋白与p53结合并阻断p53介导凋亡[31]。从肝癌细胞中分离出的HBx变体仍有维持cccDNA活跃转录的功能[32]，整合的HBV DNA表达羧基端缺失的HBx是否保有维持cccDNA转录的能力还有待进一步研究[27]。已有研究发现，保留完整DDB1结合域(aa88-100)的HBx截断蛋白仍有可能结合DDB1并保护其自身免受蛋白酶体介导的降解[33-34]。HBx通过结合DDB1使SMC5/6被泛素化降解从而解除其对cccDNA转录的抑制作用[23]，来自整合表达的羧基端截短的HBx蛋白可能也参与了慢性HBV感染长期过程中cccDNA转录活性的维持和病毒复制。

四、靶向HBx的慢性乙肝抗病毒治疗研究进展

聚乙二醇干扰素-α或正在开发的小干扰RNA(siRNA)可以通过清除包括HBx转录本在内的HBV mRNA促进SMC5/6重新出现，进而使cccDNA转录沉默[23]。干扰素诱导基因TRIM5γ可以促进K48连接的HBx蛋白K95泛素位点的泛素化降解，进而抑制HBV复制[35]。噻唑胺类抗感染药物硝唑胺(NTZ)可有效抑制HBx-DDB1蛋白相互作用，显著恢复SMC5蛋白水平，并抑制HBV转录和病毒蛋白的产生[36]。而RNA干扰可以整体降低由cccDNA产生的HBV RNA水平，进而全面抑制病毒复制，但设计时还需考虑到整合来源的HBV RNA，使之作用更为全面[37-38]。

黄爱龙团队[9]报道了NAD(P)H:醌氧化还原酶1(NQO1)的抑制剂双香豆素可剂量依赖性地降低HBx蛋白的表达。内源性NQO1能结合并保护HBx蛋白免受20S蛋白酶体介导的非泛素化途径降解，当敲减NQO1或使用双香豆素治疗可以显著减少HBx向cccDNA募集，使转录抑制因子SMC5/6蛋白再次出现，从而抑制cccDNA转录活性，阻断HBV蛋白，HBx的致癌作用也被阻断[9-10]。

直接抗病毒药物(DAAs)带来的丙型肝炎治愈为CHB治愈带来了希望。但两者维持慢性感染的机制截然不同，丙型肝炎病毒(HCV)主要通过持续的不间断的复制来维持感染；对于HBV而言，由于其cccDNA相对较长的半衰期，再加上其有效的内补充机制，仅凭借现有药物很难有效地实现CHB治愈。清除或沉默肝细胞核内的cccDNA可能是未来更有效的策略。而HBx具有多种生物学功能，无论是在cccDNA的转录调控以维持病毒的活跃复制、还是在HBV相关HCC的发生、发展中均发挥重要作用，因此以HBx为治疗靶点的抗病毒策略可能是有前景的临床治疗策略。