社区获得性呼吸窘迫综合征毒素在肺炎支原体致病中的作用

邹雨芸，陈正荣

（1.苏州大学儿科临床学院，江苏 苏州 215025；2.苏州大学附属儿童医院，江苏 苏州 215025）

社区获得性肺炎（community-acquired pneumonia, CAP）仍然是引发全世界死亡率和发病率的一个重要原因，特别是在老年人和5 岁以下儿童这些免疫力低下的人群中[1]。在住院病人中，CAP的死亡率可上升至10%，在需要机械通气和延长住院时间的重症监护病房病人中，CAP的死亡率可超过30%。在所有CAP的病原体中，非典型呼吸道病原体，如肺炎支原体正日益被认为是呼吸道感染最重要的病原体，尤其是儿童呼吸道感染[2]。在一项涉及亚洲12个医疗中心的多中心研究中，超过23%的CAP病例中发现非典型呼吸道病原体。肺炎支原体在所有CAP病例中约12%检测到，是分离的最常见的非典型病原体[3]。

在儿科人群中，肺炎支原体占所有下呼吸道感染的10%～40%[3-4]。肺炎支原体感染多发生在门诊。然而，它也是因肺炎住院的一个重要原因，特别是在老年人和儿童等免疫功能低下的患者中[5]。肺炎支原体感染的表现可以从自限性上呼吸道疾病到严重肺炎。5 岁以下的儿童通常会出现轻微的上呼吸道症状，而较大的儿童和青少年则会出现支气管肺炎，需要住院治疗。

肺炎支原体属于柔膜体纲支原体科支原体属，是细胞壁缺乏的最小的自我复制生物体，能够无细胞生存。肺炎支原体的丝状体尖端有特殊结构，在结构中可见透明腔中围绕着一个浓厚的核状中心，该核状中心为黏附于宿主呼吸道上皮细胞的结合点。尖端结构目前被认为是肺炎支原体与宿主相互作用的最主要结构。肺炎支原体侵入呼吸道后，借滑行运动定位于纤毛毡的隐窝内，以其尖端特殊结构牢固地黏附于上皮细胞表面的受体上，能抵抗黏膜纤毛的清除和吞噬细胞的吞噬，继而产生一系列的细胞毒性作用[6]。肺炎支原体的基因组很小，大约为80万碱基对，这是其有限的生物合成能力和缓慢的复制速率的原因[7]。因此，研究肺炎支原体的致病作用的一个主要障碍是缺乏对其生物学特性的知识，这是由于培养肺炎支原体存在一定的困难。

在过去的几年里，研究人员利用分子方法详细研究了与肺炎支原体相关的潜在致病因素，他们研究了不同的发病机制，如肺炎支原体的复杂黏附机制，社区获得性呼吸窘迫综合征（communityacquired respiratory distress syndrome, CARDS）毒素激活炎症小体和肺外并发症的发生等等。肺炎支原体感染诱导炎症途径主要有以下四种通路：(1)TLR2识别脂蛋白；(2)介导自噬信号；(3)炎症小体的激活；(4)黏附特性。其中CARDS毒素在肺炎支原体的炎症小体激活的步骤中发挥着很重要的作用。这篇综述将试图回顾肺炎支原体的发病机制，简单阐述CARDS毒素与呼吸道疾病发生的联系，着重突出CARDS毒素在肺炎支原体致病作用方面的进展。

1 CARDS毒素来源与结构学

在20世纪70年代和80年代开展的早期研究中，研究人员曾试图通过细胞培养与器官培养来系统性地描述肺炎支原体感染的致病机理[8-9]。仓鼠气管培养的感染特点表现为纤毛功能丧失和胞质空泡化。随后胞内空泡聚集，导致胞质变形和细胞损伤[9]。基于肺炎支原体感染的细胞毒性作用，研究人员猜想支原体膜相关的毒性因子可能是肺炎支原体的致病原因[10]。自由基产生的毒性作用只能部分解释肺炎支原体的毒性作用[11-12]。1975年，Hu等[9]证明了在肺炎支原体感染的宿主细胞中，RNA和蛋白质的合成受到抑制，同时代谢底物的摄取减少，这不能用机体的细胞黏附过程来解释。因此，Hu等[9]认为肺炎支原体对宿主细胞的主要有害影响是在DNA分子转录或翻译水平。肺炎支原体感染的细胞病变效应只有在器官培养中感染后24 h以内添加红霉素才能逆转。因此这一结论指出，机体需要合成某种蛋白质或毒素来介导宿主细胞损伤[9]。随后，Kannan等[13]在试图表征肺炎支原体的毒力因子时观察到钙依赖、胰蛋白酶敏感的肺炎支原体与人体表面活性蛋白A的结合。肺炎支原体的活性蛋白A结合被发现是有机体在呼吸道的集群中的一个关键因素。肺炎支原体的蛋白需要通过亲和层析法鉴定，然后进行纯化和测序。与黏附蛋白、细胞黏附相关蛋白或纤维连接蛋白不同，68-kDa蛋白最初被称为mpn372。它的催化位点与百日咳杆菌毒素S1亚基具有氨基酸同源性。类似于百日咳杆菌毒素S1亚基，mpn372蛋白被发现可以用来催化二磷酸腺苷核糖基化（ADP-核糖基化），并在感染细胞中具有空泡化功能[13]。通过利用哺乳动物细胞系和狒狒气管的器官培养，Kannan和Baseman[10]证实了这种蛋白质的毒力特性，并将其命名为CARDS毒素。

为解决原支原体肉汤培养中微量分离或分离量不足的问题，Kannan等[14]在大肠杆菌中表达合成了重组CARDS毒素。用重组毒素处理仓鼠卵巢细胞或HEp-2细胞，结果表明重组毒素具有将烟酰胺腺嘌呤二磷酸（NAD+）中的ADP核糖基转移到细胞蛋白氨基酸的能力。CARDS毒素的核糖化特性导致蛋白质靶点的改变，包括宿主细胞代谢途径的酶，从而导致细胞毒性。细胞病变表现为空泡化、细胞圆化和细胞变形[14]。

2 CARDS毒素在肺炎支原体发病机制

2.1 CARDS毒素导致气道上皮细胞坏死 CARDS毒素已被证明通过网格蛋白介导的内吞作用内化到哺乳动物细胞中[15]。在狒狒气管环器官培养中，重组CARDS毒素导致呼吸上皮纤毛功能丧失、胞质大量空泡化、核固缩以及上皮完整性被破坏[16]。这些毒素介导的气管环细胞毒性的进展性变化也在一定程度上解释了肺炎支原体呼吸道疾病的发病机制。CARDS毒素的空泡毒素作用与肺炎支原体感染后的组织病理改变有着重要联系，包括气道上皮细胞与纤毛细胞等空泡变性，进而导致纤毛运动障碍、纤毛剥脱、气道上皮细胞坏死脱落与气道上皮完整性缺失等改变。而胞质中空泡的大量产生多来源于细胞内吞系统的核内体、溶酶体等[17]。

2.2 CARDS毒素的促炎症作用 在小鼠和灵长类动物模型中，Kannan等[18]也针对重组CARDS毒素对呼吸道的影响进行了研究。在鼻腔接种BALB/c的小鼠诱导气道黏膜产生广泛的细支气管周围炎症和血管周围炎症。暴露于支气管肺泡灌洗液后第7天，嗜酸性粒细胞显著增加，伴有短暂中性粒细胞增多。Hardy等[19]证明，小鼠早期的细胞因子反应主要是促炎症反应，包括IL-1、IL-6、IL-12和TNF-α。在狒狒中，毒素接种导致趋化因子增加，如粒细胞集落刺激因子以及促炎细胞因子，与人类肺炎支原体感染非常相似。因此，在动物模型中，CARDS毒素暴露会引起呼吸道的促炎反应。

核苷酸结合寡聚化结构域富含亮氨酸重复包含受体是细胞内的模式识别受体因子，存在于多种细胞中，如淋巴细胞、巨噬细胞等。NLRs是作为病原体相关分子模式的传感器。最典型的NLR是髓系细胞表达的NLRP-3，在对PAMPs的反应中上调后与炎性小体结合。这种NLRP-3炎症复合体可以激活caspase-1，进而导致IL-1β的释放[20]。IL-1β是一种炎症细胞因子，它通过活化的B细胞依赖途径激活核因子轻链增强剂来放大针对感染因子的炎症反应[21]。CARDS毒素与NLRP-3炎性小体在体外小鼠骨髓源性巨噬细胞内共定位，通过NLRP-3的ADP核糖化特性激活炎性小体，随后释放IL-1β[22-23]。而CARDS毒素可以通过网格蛋白介导的内吞作用内化到哺乳动物细胞中[15]。因此，通过细胞进入CARDS毒素介导的肺泡巨噬细胞中炎症小体的激活，可以有效释放促炎细胞因子IL-1β进入气道。然而，感染后炎症小体的过度激活会导致组织损伤，因为引发气道“过度炎症”[20,24]。

2.3 CARDS毒素调控Th2分化作用 CARDS毒素在体内具有高免疫原性表位，可引起嗜酸性粒细胞增多，T细胞和B细胞积聚，产生相应的自身抗体，同时释放各种细胞因子[25]。Medina等[26]通过对肺炎支原体感染小鼠肺泡灌洗液的定量逆转录聚合酶链反应也证实了TH2细胞因子IL-4和IL-13和趋化因子、趋化因子配体-7和趋化因子配体-32的表达显著增加。细胞因子的表达增加对T细胞亚群Th1/Th2比例产生破坏，表现为Th2细胞炎性反应增强，导致黏液化生、气道高反应性增加和肺功能下降。在Medina等[26]的实验中，先前小鼠曾用卵清蛋白致敏，而重组CARDS毒素暴露导致小鼠呼吸道Th2炎症反应加重。感染小鼠的侵入性肺测量结果显示，由于气道反应性增加，进而导致气道阻力增加，肺顺应性降低。

3 CARDS毒素与疾病的关系

变应原诱导的炎症小体激活也导致肺损伤和肺重塑，这与哮喘和慢性阻塞性肺疾病的发病机制有关[27]。同时，CCL-17和CCL-22的趋化活性导致淋巴细胞和嗜酸性粒细胞的聚集、IL-4和IL-13表达的增加、嗜酸性粒细胞介导的肺部炎症和气道反应性的增加是人类哮喘发病的决定性因素。CARDS毒素在小鼠和狒狒等灵长类动物的呼吸道分泌物中也能产生类似的细胞因子和细胞特征。这些发现表明了CARDS毒素在哮喘恶化中的作用，并进一步证实了肺炎支原体感染和哮喘之间的联系。

4 总结与展望

自从采用高灵敏度的分子分析方法以来，研究人员对这种生物体的发病机制的认识有所提高，并且开始进一步研究并描述CARDS毒素的生物特征。在炎症小体的作用方面，研究人员对于免疫发病机制的认识已经取得了重大进展，它们可以作为调节疾病过程的潜在治疗靶点，例如针对相关肽的抑制剂或抗体。然而，大多数研究都是在细胞系或动物模型中进行的。因此，需要对人类亚细胞水平的发病机制进行更大规模的研究来设计出能在易感人群中产生高水平保护性免疫的疫苗。这些研究将进一步提高我们对肺炎支原体致病机制及其过程的了解与认知，特别是在机体与慢性肺部疾病和肺外并发症的关系方面。研究CARDS毒素的毒性特性可以提供新的诊疗模式，从而使肺炎支原体感染能够得到全面有效的管控。