外周血SEPT9基因甲基化检测在结直肠癌中的研究进展

陈越亚，陈卫昌

（苏州大学附属第一医院消化内科，江苏 苏州 215006）

结直肠癌（colorectal cancer, CRC）是世界上第四大最致命癌症，约占全世界每年确诊癌症和癌症相关死亡人数的10%[1]。由我国国家癌症中心公布的最新数据显示[2]，2015年中国CRC新发病例共38.76万 例，占全部恶性肿瘤发病病例的9.87%；由CRC导致的死亡病例共18.71万 例，占全部恶性肿瘤死亡病例的8.01%。CRC的发生大多由腺瘤发展而来，这一般需要10～15 年的时间，早期诊断及干预可明显降低CRC的发病率及死亡率[3]。因此，在无症状人群中筛查CRC是很重要的，同时在治疗后对CRC患者病情进行监测也是至关重要的。现在迫切需要研究出更强有力的早期筛查和检测生物标志物，以促进对这一常见恶性肿瘤的更准确的早期诊断和监测。

目前，CRC筛查方法分为侵入性及非侵入性方法两类。侵入性方法如结肠镜检查，结肠镜检查联合活检病理是诊断CRC的金标准[4-5]。Brenner等[6]在2015年进行的一项荟萃分析显示，结肠镜检查可将CRC的发病率降低69%，死亡率降低68%。然而，结肠镜检查需要彻底的肠道准备，此外，操作引起的不适和隐私的侵犯导致患者依从性差以及较高的检查成本也导致结肠镜检查不适合在人群中普及。非侵入方法包括粪便隐血试验（fecal occult blood test, FOBT）及癌胚抗原（carcinoembryonic antigen, CEA）、CA19-9等检测等更容易被人们所接受。FOBT检测主要包括愈创木脂法（guaiac fecal occult blood test, gFOBT）和免疫化学法（fecal immunochemical test, FIT）两种检测方式。两种检测方式相比，FIT对低浓度血红蛋白更敏感，在CRC诊断中敏感性和特异性更高，此外，FIT结果不受粪便中的其他成分的影响，包括药物及饮食因素[7]。因此，与gFOBT相比，FIT能够提高受试者的依从性，并确保得到更可靠的结果。但是，FIT在近端结肠中的敏感性低于远端结肠及直肠[8]，而且人们对处理粪便样本的厌恶心理一定程度上限制了粪便检测的普及。CEA及CA19-9是目前使用的基于血液的肿瘤标志物，可用于CRC诊断和监测治疗后反应，但灵敏度和特异性较低，这使得它们不适合作为CRC的筛查或诊断标志物[9]。

近年来，随着分子生物学的发展，越来越多的关于CRC的分子生物标志物被发现与研究[10]。CRC的发生是由于表观遗传变化的积累而来，这种遗传表观变化包括DNA甲基化、组蛋白修饰和通过非编码RNA调控转录后基因，这些表观遗传机制的干扰可能导致癌症的发生和发展[11]。发现体液表观遗传改变是生物标志物检测的一种创新替代方法，具有稳定性好，敏感性高，无创性等优点[12]。在所有研究的表观遗传生物标志物中，DNA甲基化是各种癌症中最常见的检测方法，其中包括CRC[13]。近年来，在CRC组织、血液和粪便样本中检测到的甲基化DNA生物标志物得到了越来越多的研究。其中，SEPT9基因甲基化检测被认为是CRC早期的一个特定的生物标志物。因此SEPT9基因甲基化可能是在高危人群中筛查CRC的可靠指标[14]。本文就外周血SEPT9基因甲基化检测在CRC中的研究进展作一综述。

1 SEPT9基因在CRC中的致病机制

Septins是一类具有GTPas活性的保守基因家族[15]，目前已发现14 个Septin基因，分别命名为SEPT1-SEPT14。SEPT9基因属于其家族中的一员，位于染色体17q25.3，参与细胞分裂、细胞骨架形成、细胞自噬等生物学过程[16-17]。SEPT9蛋白是第四细胞骨架的组成部分，在活性细胞分裂过程中可聚集形成纤维微丝和其他复合物。此外，它还招募目标蛋白并稳定胞质分裂[18]。SEPT9基因的5'端具有胞嘧啶-硫酸盐-鸟嘌呤位点（cytosinephosphate-guanine, CpG），它是DNA甲基化的主要位点[14]。当SEPT9基因甲基化后，其编码的蛋白复合物结构失去稳定，使细胞分裂过程紊乱，细胞基因组不稳定，最终导致组织癌变[19]。

DNA甲基化水平主要表现为非启动子区域的低DNA甲基化水平和基因启动子区域的高甲基化水平[20]。低DNA甲基化与转录激活有关，导致致癌基因表达增加，基因印迹丧失，染色体不稳定性增加。相比之下，高DNA甲基化与基因表达沉默和基因组不稳定性有关；减少了肿瘤抑制基因和DNA修复基因的表达；以及影响了正常细胞功能，如凋亡、DNA修复和细胞周期调节[18]。SEPT9是一种肿瘤抑制基因，已被证明在各种肿瘤中甲基化。在检测不同类型结肠病变及其邻近位点的SEPT9基因甲基化状态时，Wasserkort等[21]证明了SEPT9基因的主要高甲基化发生在CRC和腺瘤上皮细胞中的V2转录本的CpG岛3中。SEPT9基因的CpG位点高度甲基化会阻断其基因表达并导致其抗癌功能的丧失。这种DNA甲基化以两种方式抑制基因表达，促进肿瘤的发生。一方面，DNA甲基化改变了其构象，使其不被转录因子转录，最终抑制基因的表达[21]，另一方面，甲基化DNA分子招募和结合甲基化的CpG结合结构域蛋白。由于这些甲基化的CpG结合结构域蛋白继续结合其他蛋白（如组蛋白去乙酰化酶），最终形成致密而不活跃的异常染色质，从而抑制基因表达[18]。自噬是一种调节性的细胞机制，其通过减少氧化应激，消除癌基因蛋白，维持基因组稳定性来阻止细胞的恶性转化，从而发挥其抑癌作用[22]。研究[23]表明，细胞自噬抑制CRC的发生。SEPT蛋白复合物参与细胞自噬[17,23-24]。甲基化SEPT9基因可抑制SEPT9蛋白表达，降低细胞自噬功能，从而促进CRC的发生和发展。

2 SEPT9基因甲基化检测在CRC诊断中的应用

2.1 SEPT9基因甲基化检测方法 以血液为基础的SEPT9基因甲基化检测旨在检测SEPT9基因V2转录本启动子区域的异常甲基化[25]。该方法的发展是基于甲基化的SEPT9基因从坏死和凋亡的CRC细胞释放到外周血液循环中，并能应用多重实时荧光定量多聚酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR）将其在外周血中检出，在CRC辅助诊断方面展示了较高的灵敏度和特异度[26]。基于血浆中SEPT9基因启动子甲基化引起的表观遗传沉默，Epigenomics AG公司[27]在2008年首先利用欧洲可用的SEPT9生物标志物对SEPT9甲基化进行了研究，并推出了第一代有CE标示的Epi proColon实时PCR试剂盒。2016年4月，FDA批准Epi proColon作为50～75 岁平均风险人群的首个基于血液的CRC筛查试验[28]。此外，随着后续研究中的不断改进，特别是在应用第二代Epi proColon 2.0实时PCR试剂盒后，SEPT9基因甲基化检测灵敏度从48.2%～73.3%[28-31]提高到71.0%～95.6%[32-35]，特异度从80.0%～91.5%提高到84.8%～98.9%。现在，外周血SEPT9基因甲基化检测因其特异性高、敏感性高、患者依从性高等优点，在我国CRC筛查、诊断、预后、复发监测中得到了广泛的应用[18]。

2.2 SEPT9基因甲基化检测在CRC筛查中的作用 在一种疾病的早期诊断中应用一种检测方法通常意味着这种检测方法可作为该疾病的验证性诊断或“金标准”诊断的补充或辅助方法，并可用于提高该疾病早期诊断率或阳性检出率。检测方法在筛查中的应用是指该检测可以独立地在基于人群的筛查活动中识别某些疾病的高危个体，而在筛查后通常需要进行确认性诊断[25]。SEPT9基因甲基化不仅可以发生在CRC中，还发生在其他恶性肿瘤中。Grützmann等[36]比较了SEPT9基因在各种恶性肿瘤患者外周血中的甲基化状态。研究显示，CRC患者的SEPT9甲基化阳性率为72%（90/125），而非CRC患者的阳性率仅为11.5%（11/96），这证实了SEPT9基因甲基化可作为CRC一个高特异性诊断标志物[36]。在CRC筛查过程中，筛查方法的高特异性有利于排除非癌样本，避免不必要的结肠镜检查。

2.3 SEPT9基因甲基化检测在CRC诊断中的算法选择 由于SEPT9检测是为了在未发生甲基化的SEPT9 DNA的强背景下检测微量甲基化SEPT9的基因拷贝，而可检测到的甲基化的SEPT9 DNA拷贝数可低至7.8 pg/mL，因此大多数研究都进行了多次PCR反应以提高SEPT9基因甲基化检测的灵敏度[25]。目前有关SEPT9基因甲基化检测的研究总共包括四种算法：Septin9(1/3)算法（三个PCR重复中，至少有一个检测结果显示阳性）、Septin9(1/2)算法（两个PCR重复中，至少有一个检测结果为阳性）、Septin9(2/3)算法（三个PCR重复中，至少有两个检测结果为阳性）、Septin9(1/1)算法（仅有一个PCR重复，且检测结果显示阳性），不同算法会影响SEPT9基因甲基化检测结果的灵敏性和特异性[38]。算法的选择是基于检测的具体需要。如果优先考虑排除健康阴性人群，例如在早期检测试验中用于诊断目的，则应使用特异性最高的算法，然而，如果优先考虑的是识别尽可能多的真实患者以提高疾病检出率，例如在筛查试验中，应使用灵敏度最高的算法。筛查试验中的高假阳性率问题可以通过进一步的诊断检查来解决，而诊断试验中的高漏诊率可以通过常规的筛查方案来避免。Song等[25]比较了四种算法的敏感性和特异性，研究显示，在CRC诊断中，SEPT9基因甲基化检测采用Septin9(1/3)算法表现出最佳的灵敏度，而SEPT9基因甲基化检测采用Septin9(2/3)算法表现出最佳的特异度。Septin9(1/3)算法或Septin9(2/3)算法的选择取决于研究的目的。

2.4 SEPT9基因甲基化检测在CRC癌前病变中的应用 对于SEPT9基因甲基化检测对CRC癌前病变的筛查，有研究[35]显示，在腺瘤中的敏感性为11%～19%，特异性为85%～94%；在息肉中的敏感性为3%～8%，特异性为90%～97%。在腺瘤和息肉中的敏感性都很低，这表明SEPT9基因甲基化检测对CRC癌前病变的诊断价值有限。但是，另有研究[37]表明，外周血SEPT9基因甲基化检测在高危腺瘤和多发小息肉中敏感性分别为21.6%及20.0%。这是SEPT9基因甲基化检测在CRC诊断中的重要扩展，因为检测CRC癌前病变可对其进行早期干预和清除，这可以降低CRC的发生率和死亡率。

2.5 SEPT9基因甲基化检测在CRC临床分期中的应用 虽然SEPT9基因甲基化检测在诊断CRC中具有较高的敏感性和特异性，但检测早期CRC的能力比检测晚期CRC更为重要，因为在早期诊断CRC后可以实施早期干预，以提高治愈率和降低死亡率。Jin等[33]研究表示，在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期CRC患者中，外周血SEPT9基因甲基化检测采用Septin9(2/3)算法阳性率分别为66.7%、82.6%、84.1%和100%，表明SEPT9基因甲基化检测在早期CRC中有一定的检出率，可为CRC早期诊断提供依据。外周血SEPT9基因甲基化检测的阳性率随着CRC的进展而增加，这可能与随着原发性肿瘤细胞坏死和凋亡的增加引起释放到外周血中的SEPT9基因DNA的增加有关。

3 SEPT9基因甲基化检测在CRC治疗中的应用

3.1 SEPT9基因甲基化检测在CRC术后监测中的应用大多数早期CRC患者进行了手术治疗，以切除原发性病变和区域转移淋巴结[38]。然而，尽管根治性切除术切除彻底，仍有30%～50%的患者将面临CRC复发并死于肿瘤转移[39]。进行CRC复发或转移的术后监测，并通过及时治疗可延长患者生存时间。定期进行CT检查及CEA检测是监测CRC复发最常见的两种方法[40]。然而，CT扫描对小病变（直径＜1 cm）的敏感性有限，并且具有较高的假阳性率[41-42]。CEA检测是目前唯一被推荐用于常规监测CRC复发的基于血液检测的方法，但其敏感性和特异性仍欠佳[9]。因此，迫切需要开发新的敏感生物标志物来监测CRC的复发或转移。

外周血SEPT9基因甲基化检测除了在CRC的早期诊断和筛查中应用外，已经显示出了评价CRC疗效和监测CRC复发的潜力。在一项研究中，9 例接受根治性手术的CRC患者分别检测了术前及术后的外周血SEPT9基因甲基化水平。结果显示，在术后平均118 d时，有8 例患者SEPT9基因甲基化检测结果转阴，同时CRC复发的患者SEPT9基因甲基化检测结果恢复阳性。此外，SEPT9基因甲基化检测结果阳性的患者有发生远处转移的倾向，并且无病生存率（disease-free survival, DFS）较低，并与SEPT9基因甲基化水平成负相关[43]。虽然该研究的样本量很小，但它表明外周血中的SEPT9基因甲基化具有作为CRC术后复发监测指标的潜力与价值。

3.2 SEPT9基因甲基化检测在CRC预后中的应用SEPT9基因甲基化检测也显示出了在CRC中预测生存率的潜力。Shen等[44]进行了一项系统回顾和Meta分析研究，结果证明了SEPT9基因甲基化检测结果阳性的CRC患者癌症预后更差，总生存率（overall survival, OS）更低（HR＝2.07，95%CI：1.40～3.06），提示SEPT9基因甲基化检测结果阳性的癌症患者与检测结果阴性的癌症患者相比，OS降低的风险将增加2倍。其次，术前外周血中检测到SEPT9基因甲基化检测结果阳性的CRC患者的OS较差（HR＝3.25，95%CI：1.93～5.48），这项研究结果意味着SEPT9基因甲基化检测是评价患者CRC预后的一种方便而有前途的方法。

4 SEPT9基因甲基化检测与其他CRC检测方法的联合应用

进行多种检测标记物或方法的联合应用已成为CRC诊断和筛查的一种发展趋势。Jin等[33]的研究表明，SEPT9基因甲基化检测单独检测CRC的敏感性为76.8%，FIT单独检测CRC的敏感性为58.0%，而SEPT9基因甲基化检测和FIT联合检测CRC的敏感性为94.2%，特异性为92.6%。此研究表明，SEPT9基因甲基化检测和FIT检测方法的联合应用与它们任一单独检测CRC相比，显著提高了CRC检测的灵敏度。Wu等[34]最近进行的一项研究表明，SEPT9基因甲基化检测联合FIT对CRC检测的敏感性为94.4%，SEPT9基因甲基化检测、FIT和CEA三项联合检测CRC的灵敏性为97.2%，而SEPT9基因甲基化检测单独检测CRC的敏感性仅为76.6%。此外，除上述检测方法外，SEPT9基因甲基化检测还可以与其他现有的CRC检测生物标志物联合应用，如糖蛋白标记物或其他甲基化标记物[37]。由Tänzer等[45]发表的一项研究表明甲基化的SEPT9和ALX4的联合检测在结直肠息肉的检测中具有重要意义，其灵敏度和特异性分别达到71%和95%。另一项研究[46]发现，SEPT9基因甲基化检测和FIT联合检测晚期腺瘤的敏感性为67.6%，特异性为47.4%，而SEPT9基因甲基化检测单独检测晚期腺瘤时的敏感性仅为10.8%，这提示SEPT9基因甲基化检测和FIT两项检测方法的联合应用可以提高晚期腺瘤的阳性检出率。这些研究表明了联合检测在检测结直肠晚期癌前病变中的潜在应用价值。然而，尚需要进一步的研究来评估生物标志物的联合检测对CRC检测和筛查的应用价值。

5 结语

外周血SEPT9基因甲基化检测在CRC诊断和筛查中敏感性及特异性较高，目前有关外周血SEPT9基因甲基化检测的四种算法中，Septin9(1/3)算法灵敏性最高，Septin9(2/3)算法特异性最高。可根据研究的目的进行周血SEPT9基因甲基化检测的算法选择，满足实际检测需求。SEPT9基因甲基化检测在诊断癌前病变、术后复发监测和预后评价方面有一定应用潜力，尚需大量临床数据加以验证。