外泌体在免疫介导性眼病中的研究进展

刘 笑，马诗思，钟敬祥

0引言

眼睛由于存在血眼屏障、缺乏淋巴引流系统等原因，常常被认为是免疫赦免器官。尽管如此，眼部仍可发生严重的免疫介导性眼病(immune-mediated eye diseases,IMED)，如甲状腺相关眼病(thyroid-associated ophthalmopathy,TAO)、自身免疫性葡萄膜炎(autoimmune uveitis,AU)及Sjögren综合征(Sjögren syndromes,SS)等，轻则影响患者的日常生活，重则引起严重的视力损害，甚至失明。现阶段，临床上以糖皮质激素及免疫抑制剂为主的治疗方法疗效欠佳、且易复发，因而亟需开拓该类疾病的诊治思路与策略。外泌体是一种由细胞分泌的脂质双分子层囊泡，其中包含蛋白质、脂质及核酸等生物活性分子，在细胞间通讯起着重要的媒介作用[1]。既往研究发现，外泌体具有重要的炎症及免疫调节作用[2]。一方面，病损细胞分泌的外泌体密切参与了IMED的发生与发展；另一方面，某些细胞(如间充质干细胞)分泌的外泌体还可用于IMED的治疗。因此，本文拟对外泌体在IMED中的研究进展作一综述。

1外泌体概述

1.1外泌体的来源与组成细胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)根据其生物学来源和大小可分为外泌体、微囊泡及凋亡小体。三者的直径差别较大，外泌体一般为30～150nm，微囊泡为100～1000nm，而凋亡小体分子直径常>1000nm，发挥的生物学功能也有差异[3]。近年来，外泌体在疾病中所发挥的作用受到了越来越多人的关注。外泌体首次于1983年由Johnstone等[4]在绵羊网织红细胞上清液中发现，广泛存在于多种体液中[5-6]，其中就包括眼睛的房水、泪液、玻璃体等[7-9]。此外，外泌体携带有丰富的蛋白质，包括广谱蛋白和特异性蛋白。广谱蛋白与细胞来源无关，而特异性蛋白与细胞的来源相关，可以反映组织细胞的特异性，如T细胞来源的外泌体含有CD3分子[10]、心肌细胞来源的外泌体含肌节蛋白[11]、神经元分泌的外泌体含有谷氨酸受体等[12]。值得注意的是，外泌体还携带有如DNA、mRNAs、miRNAs等多种核酸分子，可与受体结合介导细胞内的信号调控，从而改变细胞功能。研究表明外泌体在血管生成、免疫抑制和癌症等方面发挥着重要的作用[13-14]。除此之外，某些细胞分泌的外泌体还可用于疾病的治疗，如间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)来源的外泌体(MSC-Exos)保留了其亲本MSCs的特征，具有免疫调节、抑制炎症反应及受损组织修复等功能[15-16]，可用于骨关节炎、特发性肺纤维化及眼科疾病等多种疾病的治疗[17-19]。

1.2外泌体的免疫调节作用研究发现外泌体能有效激活或抑制机体的免疫应答，并可促进炎症反应，参与肿瘤、自身免疫性疾病的发生与发展[2]。不同类型的细胞分泌的外泌体发挥的功能及作用也有差异。由T淋巴细胞、B淋巴细胞及巨噬细胞等免疫细胞分泌的外泌体具有免疫调节功能，可以影响天然免疫及获得性免疫，参与抗原的提呈、T细胞的活化、免疫抑制及抗炎等过程[20-21]。值得注意的是，除免疫细胞外，非免疫细胞源性的外泌体也受到了越来越多人的关注。Poggio等[22]发现肿瘤细胞产生的外泌体可使细胞发生程序性死亡、阻止T细胞活化，从而促进肿瘤细胞的增长。此外，研究表明炎症刺激可以使MSC-Exos分泌增加，从而增强了抗炎及免疫抑制的能力[23-25]。由此可见，外泌体的生物学功能与其细胞来源及微环境紧密相关，但其在IMED中的研究有待我们进一步深入挖掘与探讨。

2外泌体参与免疫介导性眼病的发生发展

2.1外泌体与甲状腺相关眼病TAO是一种危及视力且损伤外观的特异性自身免疫性疾病，为Graves病(Graves’ disease,GD)的眼部临床表现[26]。由于甲状腺和眼周组织具有共同抗原，疾病状态下免疫耐受平衡失调，可引起眼眶炎症反应，导致眼肌纤维化、肿胀及局部脂肪增生，出现眼球突出及视神经受压等临床表现，严重影响患者的视力健康。目前，外泌体(或EVs)参与TAO的发生发展尚缺乏直接研究证据，但有研究表明外泌体与GD的发生发展密切相关。Hiratsuka等[27]研究发现，与健康对照组或GD缓解组患者相比，难治性GD组患者外周血单核细胞分泌的外泌体可使IL-1、TNF-α及IL-6表达增多，这提示了外泌体可能在GD的发病机制中发挥着重要的作用。此外，Edo等[28]研究表明，在正常和癌变的甲状腺细胞系所分泌的外泌体中均存在甲状腺刺激激素受体(thyroid stimulating hormone receptor,TSHR)，TSHR可与自身抗体结合发挥作用，从而减轻GD患者的症状。因此，我们有理由推测病损细胞分泌的外泌体涉及了TAO的发生与发展，但仍亟待进一步研究探索。

2.2外泌体与自身免疫性葡萄膜炎葡萄膜炎是发达国家致盲的主要原因之一[29]。AU为非感染性葡萄膜炎，该病可以单独发生在眼部，如交感性眼炎、特发性葡萄膜炎等；也可以是全身系统性疾病的眼部表现，如全身性结节病、Behcet病及V-K-H综合征等。目前，临床上治疗AU的方法主要包括糖皮质激素及免疫抑制剂，存在治疗效果欠佳、全身及局部毒副作用大等问题[30-31]。有研究表明，AU的免疫反应主要由T淋巴细胞介导，为Th17细胞及其相关的炎性因子共同作用下完成的。Knickelbein等[32]研究发现，当葡萄膜炎累及到视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞时，可刺激RPE细胞分泌外泌体，抑制T淋巴细胞的增殖，从而阻止免疫反应的进一步发展。

2.3外泌体与角膜移植排斥反应角膜病是我国主要的致盲性眼病之一，角膜移植手术是治疗角膜盲的主要方法。角膜作为无血管的透明组织，享有相对的免疫赦免特权。尽管如此，免疫排斥反应仍是导致角膜移植手术失败的主要原因[33]。有研究表明，角膜移植排斥反应主要为同种异体排斥反应，移植后受体T细胞识别供体的主要组织相容复合物抗原而引发免疫应答[34-35]。研究表明，在角膜伤口愈合过程中小鼠角膜上皮细胞源性外泌体可诱导成纤维细胞增殖，并将角膜细胞转化为成肌纤维细胞，从而介导角膜上皮和基质之间的细胞间通讯[36]。此外，Leszczynska等[37]研究发现人角膜缘基质细胞源性外泌体可显著增强角膜缘上皮细胞的增殖并促进角膜伤口愈合，其作用机制可能是通过激活Akt信号通路实现的。总而言之，外泌体在角膜移植排斥中起到了重要的作用，为角膜损伤和移植排斥提供了新的诊治思路。

2.4外泌体与Sjögren综合征SS是一种可累及多器官的慢性炎症性自身免疫性疾病，其主要累及唾液腺及泪腺，可引起口干、眼干等不适，严重影响患者的生活质量。SS的发病率约为1%，其中约90%患者为女性[38]。Kapsogeorgou等[39]研究发现，静止的及活动的唾液腺上皮细胞所分泌的外泌体均含有Ro/SSA、La/SSB及Sm RNPs等自身抗原，并且RNPs在SS患者和健康者的外泌体中均显著表达。此外，Michael等[40]首次成功地从唾液中分离并鉴定出携带miRNA的外泌体，提示检测唾液外泌体的蛋白质和miRNA水平可能有助于SS的诊断，但我们需要更多的研究来评估唾液外泌体miRNA在SS诊断和预后中的价值。

2.5外泌体与年龄相关性黄斑变性年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration,ARMD)是一种与年龄相关的致盲性、退行性眼底病变，是导致老年人失明的主要原因[41]。ARMD可分为干性和湿性两大类，其中干性ARMD占比约为80%，以黄斑区地图状萎缩及玻璃膜疣为特点；而湿性ARMD的特征主要为RPE层的功能退化及脉络膜新生血管(choroidal neovascularization,CNV)的形成，CNV极易引起出血和渗出，影响患者视力。目前，ARMD的发病机制尚不完全清楚。有研究表明，ARMD的病理过程不仅与退化有关，还与免疫反应及炎症反应有关[42]。Zhang等[43]研究发现在蓝光的氧化刺激下，RPE衍生的外泌体可能通过上调NLRP3炎性小体来加剧氧化反应，从而加剧ARMD病程的发展。此外，补体系统在ARMD的发病过程中也起着十分重要的作用[44]。Wang等[45]研究发现在老化的视网膜中补体因子H功能异常，可使含有C3分子的RPE细胞源性外泌体遭受白细胞攻击，导致外泌体膜不稳定及细胞内蛋白释放，从而促进玻璃膜疣的形成；此外，该研究还发现CD63及CD8等外泌体标志物在ARMD中表达，而在健康对照组中不表达，这表明RPE细胞来源的外泌体在ARMD中与补体驱动的先天免疫反应有关。

3外泌体对免疫介导性眼病的治疗潜力

外泌体不仅参与了IMED的病理生理过程，某些细胞来源的外泌体还对疾病有治疗作用。外泌体的功能与其细胞来源紧密相关，其中研究最多的为MSC-Exos。MSCs为多功能干细胞，其分泌的外泌体具有免疫调节、抑制炎症反应及受损组织修复等功能，可用于多种眼科疾病的治疗。此外，眼部组织来源的细胞如RPE细胞、角膜上皮细胞等分泌的外泌体也可用于眼科疾病的治疗。

Shigemoto-Kuroda等[46]发现人骨髓来源的MSC-Exos对AU的治疗效果明显，可显著抑制T细胞增殖及Th1、Th17的发育。此外，Bai等[47]研究发现局部注射人脐带来源的MSC-Exos可减轻白细胞浸润并有效缓解大鼠葡萄膜炎的症状，其作用机制主要是通过抑制炎症细胞迁移来发挥作用。值得一提的是，外泌体对角膜移植排斥也有一定的治疗作用。贾喆等[48]发现MSC-Exos可以通过抑制CD4+细胞从而达到抑制角膜移植排斥的效果。Jangamreddy等[49]发现角膜上皮细胞来源的外泌体可以促进角膜组织的再生。除此之外，Han等[36]发现小鼠角膜上皮细胞来源的外泌体含有与伤口愈合和新生血管形成相关的蛋白质，包括血小板反应蛋白-2、转化生长因子β结合蛋白1等，对角膜移植术后的伤口的愈合起到了重要作用。

在SS方面，Li等[50]研究发现结膜下注射MSC-Exos可明显改善SS兔子的干眼症状、减轻泪腺的炎症反应，考虑与泪腺巨噬细胞的极化调节作用及靶向NF-κB信号传导增强了Treg和Th2的免疫应答有关。由此可见，MSC-Exos在无细胞疗法治疗SS干眼上有广阔的应用前景。值得注意的是，外泌体对ARMD也有一定的治疗效果。Aboul Naga等[51]研究发现贝伐单克隆抗体对ARMD的治疗作用与外泌体有关，RPE细胞源性外泌体标志物CD63与贝伐单克隆抗体存在共定位现象，提示贝伐单克隆抗体存在于RPE源性外泌体中。此外，Hajrasouliha等[52]发现视网膜星形胶质细胞来源的外泌体可以同时攻击巨噬细胞和血管内皮细胞，对激光诱导的视网膜血管渗漏和CNV具有明显的抑制作用。总而言之，多种细胞来源的外泌体对多种IMED均有一定的治疗作用。但是，外泌体是否可用于TAO的治疗目前尚不明确，亟待进一步研究与探讨。

4眼部疾病的外泌体生物标志物

近年来，研究发现某些细胞来源的外泌体及其携带的分子可作为生物标志物用于疾病的诊断及预测，尤其是在肿瘤方面[53]。有研究表明，对血清外泌体的表面蛋白进行检测有助于癌症的早期诊断及分类[54]。在眼睛方面，识别眼部体液中的外泌体生物标志物对眼部疾病的早期诊断具有重要的意义。Ragusa等[9]研究发现葡萄膜黑色素瘤患者的前房及血清的外泌体miR-146a表达明显增高。因此，外泌体miR-146a可能为葡萄膜黑色素瘤的潜在标志物。Dismuke等[7]及Kang等[55]研究发现，房水中的外泌体及其携带的miRNA或蛋白质有望成为青光眼及新生血管性ARMD的诊断性生物标志物。除此之外，Ahn等[56]研究表明RPE细胞分泌的EVs miR-494-3p在非新生血管性ARMD的RPE线粒体损伤中发挥着重要的作用，有望成为ARMD的潜在生物标志物。总体而言，随着外泌体特异性分离技术及其蛋白质和核酸定量检测方法的不断更新，外泌体作为眼部疾病特异性生物标志物的应用将越来越广泛。

5总结与展望

综上所述，外泌体作为一种由细胞分泌的脂质双分子层囊泡，在细胞间通讯和免疫调节等方面起着重要的作用。一方面，病损细胞分泌的外泌体介导了IMED的发生与发展，这提示了外泌体作为IMED诊断或预后标志物的潜在价值。另一方面，MSCs等细胞来源的外泌体在IMED的治疗上具有良好的应用前景，但目前存在的诸多应用困境(如外泌体的最佳细胞来源、输注途径、治疗时机及剂量、外泌体与免疫抑制剂的协同治疗等)有待攻克，其安全性及疗效也有待更为深入的临床前及临床研究予以论证。我们相信，随着研究思路和研究技术的不断进步，外泌体与IMED的研究有望得到突破，并为IMED的诊治提供新策略、开辟新路径。