激光共聚焦扫描显微镜观测自噬小体变化的应用

张冰娜，叶丹彦，张丹桂，李 璐，杨旅军

（汕头大学医学院第二附属医院转化医学研究中心，广东 汕头 515041）

心血管疾病是世界范围内危害人体健康的重要疾病，其中心肌梗死是心血管疾病的最常见疾病之一.在中国，心血管疾病的发病率和死亡率逐年升高，且呈现年轻化趋势，严重危害着人们的健康，给社会和家庭带来了巨大的经济和精神负担.研究报道[1]，心肌细胞损伤时细胞自噬参与疾病的整个过程并发挥着重要作用.细胞自噬（autophagy）是指细胞应对外部环境变化时的一种代谢方式，在基础状态下自噬水平较低，用于维持内环境的稳态和细胞存活；在缺血缺氧条件下，细胞能量或营养供应不足，导致细胞自噬被显著激活，激活的自噬小体可用于清除损坏的细胞器或侵入的病原体，广泛参与各种病理生理过程[2].然而，其他研究指出缺血再灌注导致的细胞自噬过度激活，不利于心肌细胞存活[3].因此，准确观测细胞自噬小体的变化情况对于理解心肌损伤机制并及时作出正确干预具有重要临床意义.

目前，普通型正置荧光显微镜由于其高分辨率被广泛用于对样品结构和组成成分进行定位和定性检测.然而，正置显微镜技术存在成像速度慢、精确度有限及荧光散射伪影重等不足.激光共聚焦扫描显微镜（laser confocal scanning microscope，LCSM）作为一种先进的细胞分析仪器，具有高精确度、高分辨率、高灵敏性以及高放大倍数等特性，可以在细胞层面对样本进行断层、逐点、逐行和逐面等快速扫描成像，在生物医学中具有广泛应用价值[4].因此，本研究旨在利用激光共聚焦扫描显微镜技术检测低氧诱导小鼠心肌细胞损伤自噬小体变化情况.

1 材料与方法

1.1 主要仪器和试剂

仪器：激光共聚焦扫描显微镜（Leica TCS SPE），正置荧光显微镜（OLYMPUS BX51）.

试剂：含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基（美国，Gibco），0.25%胰蛋白酶，1倍的磷酸盐缓冲液（PBS）.

细胞：胚胎小鼠心肌细胞.

1.2 低氧缺氧诱导小鼠心肌细胞自噬小体形成

将小鼠心肌细胞消化后接种于铺有盖玻片的六孔板中.待细胞长至80%，低氧诱导组换成缺氧液，于1% O2和5% CO2三气培养箱培养3 h后复氧1 h.

1.3 免疫荧光染色

将低氧缺氧诱导组和对照组的培养基去除干净，PBS洗3次，3 min/次.加入4%多聚甲醛固定20 min，PBS洗3次，3 min/次.加入0.1% TritonX-100透化15 min，PBS洗3次，3 min/次.加入山羊血清工作液封闭20 min，去除血清，加入稀释的LC3A/B一抗（1∶250，Cell Signaling Technology#4180）4℃孵育过夜.用PBS洗3次，3 min/次，避光加入稀释的山羊抗兔荧光二抗（1∶500，碧云天，Alexa Fluor 488标记山羊抗兔IgG（H＋L））37℃孵育1 h，用PBS洗3次，3 min/次，加入DAPI工作液细胞核衬染（碧云天，Irving Blue（0.5%，SIGMA）细胞浆衬染，PBS洗净后，镜检.（见表1）

1.4 应用激光共聚焦扫描显微镜和正置荧光显微镜对图片进行采集

激光共聚焦扫描显微镜（Leica TCS SPE）采集：Alexa Fluor 488激光激发波长：480～495 nm；Irving Blue激光激发波长：543～575 nm；DAPI激光激发波长359 nm.同时采集绿色、红色、蓝色以及三色叠加图.

正置荧光显微镜（OLYMPUS BX51）采集：选择荧光滤镜：1-DAPI、2-FITC、3-Rhod，分别采集蓝色、绿色、红色图像，然后通过软件将3图进行合并.

2 结果

2.1 低氧缺氧诱导小鼠心肌细胞自噬小体形成

细胞在氯喹抑制下出现了明显的自噬小体.利用低氧环境+缺氧液方法诱导小鼠心肌细胞损伤并自噬小体形成是可行的.与正常对照组比较，低氧缺氧诱导小鼠心肌细胞损伤组自噬小体呈高表达状态.

2.2 正置显微镜和激光共聚焦显微镜检测自噬小体表达情况的差异

正置显微镜和激光共聚焦显微镜检测自噬小体表达情况如图1（见封3）.自噬小体分泌的抗原可以与Alexa Fluor 488标记的LC3A/B抗体结合，呈现绿色；DAPI衬染细胞核为蓝色；Irving Blue衬染细胞浆呈红色；3者叠加图（Merge）可清晰观察自噬小体在心肌细胞内的位置及表达情况.与正置显微镜比较，激光共聚焦显微镜成像速度快，图像清晰及灵敏度高.

3 讨论

细胞自噬是真核细胞内一种非常重要的生理过程，主要通过亚细胞膜结构的变化并经溶酶体介导对细胞内的细胞器、蛋白质和膜磷脂进行降解，维持细胞合成和代谢的平衡，进而维持细胞内环境的稳定.本实验结果发现低氧缺氧诱导小鼠心肌细胞损失可以引起自噬小体高表达，与既往类似研究适度刺激引起的细胞自噬作用对缺氧心肌细胞具有一定保护作用的结果基本一致[5].细胞自噬起始于自噬小体的形成，当细胞自噬被激活时，自噬小体表达的LC3发生膜型转化，主要分布在细胞膜上；细胞自噬未被激活时，LC3仍停留在细胞浆内，呈散在块状分布[6].现在普遍观点认为，在心肌病变早期细胞自噬被认为是一种保护性机制.然而，有研究指出过度激活细胞自噬，不利于心肌细胞的存活[3].因此，快速准确检测细胞自噬时自噬小体的表达情况对于指导临床干预具有重要应用价值.

免疫荧光法是目前检测自噬小体的常用方法，主要仪器包括普通正置荧光显微镜和激光共聚焦扫描显微镜.普通正置荧光显微镜由于操作方便、费用低和仪器比较普遍等特点被广泛应用于实验研究.然而，正置荧光显微镜在使用过程中只能局限于单个波长拍照，之后再合并不同通道的图像，存在成像速度慢等缺点.另外，正置荧光显微镜会随着次级荧光的干扰，使图像清晰度下降，同时也会受曝光时间、增益影响，出现不同荧光染料的交叉干扰，无法在需要高灵敏度的实验中获取精确图像[7].除此之外，正置荧光显微镜需要人肉眼观察得出结果，存在主观因素的干扰，无法客观准确地对自噬小体的位置和含量进行评估.激光共聚焦扫描显微镜作为一种先进的荧光成像技术，主要利用激光作为扫描光源，采用光源针孔与检测针孔共轭聚焦技术，对样本进行快速的点、线或二维图像成像[4，8].由于激光束的波长较短，光束很细，其分辨率大约是普通光学显微镜的3倍.另外，激光共聚焦扫描显微镜不仅可以通过多通道荧光捕获技术同时获取多标记荧光图像，减少多色荧光之间的波段叠加，抑制图像的模糊；还可以与其他多种先进技术兼容达到联合应用的目的[9].总之，激光共聚焦扫描显微镜已成为分子生物学、形态学、细胞学、药理学和遗传学等领域强有力的研究工具.

随着科学研究的不断深入，激光共聚焦扫描显微镜在细胞结构[10]、核酸及蛋白质[11]、细胞内自由基活性[12]、细胞内钙离子浓度变化[13]、膜电位[14]等生命科学研究中发挥重要的作用.近年来，新开发的高速活细胞双转盘式共聚焦系统进一步提高了检测的灵敏度、图像的采集速度，同时降低了光毒性.因此，激光共聚焦扫描显微镜具有检测速度快、灵敏度高、定位精确和多色荧光成像等优点，可以直接探测活细胞在化学因子、细胞因子或激素等作用下所致的离子细微动态变化，是目前检测自噬小体变化的最为先进仪器之一.