牙龈卟啉单胞菌与不良妊娠结局的相关研究进展

齐 帅，林晓萍

牙周病是由于牙周病原菌和宿主免疫防御系统长期相互作用所致，有学者提出少数特定微生物引起的宿主口腔菌群的持续性失调是引起牙周组织破坏的主要原因，极低水平(细菌总数的0.01%)的牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis,P.gingivalis)可诱发小鼠牙周炎，并造成局部细菌数量和菌群结构的显著改变，因此P.gingivalis也被称为“关键致病菌”[1]。P.gingivalis的毒力因子如脂多糖、菌毛、牙龈素等既能够直接破坏组织，也可诱导宿主局部和系统性免疫应答产生间接免疫病理损伤。现有的证据表明牙周炎与先兆子痫(preeclampsia, PE)[2-3]、胎膜早破(premature rupture of membranes, PROM)[4]、胎儿宫内发育迟缓(intrauterine growth retardation, IUGR)[5]和早产低出生体重儿(preterm low birth weight, PLBW)[6]等多种不良妊娠结局(adverse pregnancy outcomes, APO)有关。现有的证据表明，P.gingivalis的存在可以部分解释这种相关性，P.gingivalis能够入侵牙周或母胎组织，造成全身和胎盘组织的免疫环境失调和氧化应激，引起子宫螺旋动脉重塑不良以及胎盘血管内皮功能障碍导致APO。

1 P.gingivalis对母胎组织的入侵

研究发现P.gingivalis不仅存在于牙周组织和牙菌斑，也存在于某些APO患者的母胎组织中。研究者对P.gingivalis的来源尚未达成共识，目前普遍认为P.gingivalis能通过泌尿生殖道经上行途径到达胎盘单位，也可以利用自身的毒力因子如菌毛、牙龈素等粘附并破坏牙周组织，通过口腔血行播散到达母胎界面[7]。

多个研究为P.gingivalis在母胎组织的存在提供了证据。Amarasekara等[8]在PE孕妇的胎盘标本中找到了包括P.gingivalis在内的多种牙周致病菌，而对照组胎盘标本中未发现P.gingivalis。Parthiban等[9]发现PE孕妇胎盘组织的P.gingivalis显著高于正常血压孕妇，提示P.gingivalis可能与孕妇的血压升高有关。除胎盘组织外，在PE患者的脐带中也检测到了P.gingivalis的存在，Vanterpool等[10]为确定P.gingivalis在胎盘和脐带中的位置是否与不同妊娠并发症有关，用免疫荧光法在胎盘和脐带样本的连续切片中检测P.gingivalis抗原，结果显示P.gingivalis在脐带中的存在与PE显著相关，而胎盘绒毛间质中的P.gingivalis只在早产孕妇体内检出，这些研究揭示了P.gingivalis对母胎组织的入侵行为。有研究从另一角度揭示了P.gingivalis与APO的相关性，研究者们发现PLBW和PE患者口腔牙周袋内的P.gingivalis水平显著高于健康孕妇[11-12]，但是这些研究并未同时检测这些孕妇胎盘组织中是否也存在P.gingivalis。

2 P.gingivalis影响子宫螺旋动脉重塑

妊娠过程受多种细胞、细胞因子和信号转导通路的调控，绒毛外滋养层细胞(extravillous trophoblast cell, EVT)在其中扮演重要角色，在妊娠中期由滋养层细胞分化而成的EVT向子宫血管内皮和肌层的侵袭是子宫螺旋动脉重塑的关键，这一步骤可以改善胎盘的血供，对胎盘的发育和成熟至关重要。EVT的功能受损一方面会导致子宫螺旋动脉重塑不足，胎儿因血供不足而营养不良甚至死亡。另一方面，血流灌注不足的胎盘能够释放大量促炎细胞因子、抗血管生成因子和游离细胞DNA等进入母体循环，扰乱母体内皮功能导致全身炎症反应，这被认为是孕妇PE的主要原因之一[13]。

多个研究显示P.gingivalis能够通过不同信号通路诱导EVT凋亡。P.gingivalis可通过激活ERK1/2及其下游效应因子诱导EVT的G1期阻滞和细胞凋亡[14]，该过程还可以通过P.gingivalis激活JNK和p38信号通路实现[15]，Ren等[16]认为EVT凋亡与P.gingivalis激活ERK1/2和p38信号通路诱导IL8和IFN-γ分泌有关。此外，Guo等[17]在体外用P.gingivalis(ATCC33277)感染人EVT细胞(HTR-8/SVneo细胞)，发现HTR-8细胞体积收缩并逐渐失去细胞连接，随着时间的推移，感染细胞的细胞骨架变得更密集，细胞核变得更小。感染后的HTR-8细胞凋亡百分比显著提高，PI3K/Akt信号通路对该过程具有抑制作用。

除引起细胞凋亡外，P.gingivalis还能够影响滋养层细胞的侵袭能力，将HTR-8/SVneo细胞接种于含或不含P.gingivalis的人工基膜上24 h，该细胞的侵袭能力呈现出依赖于P.gingivalis剂量的抑制现象[18]。P.gingivalis对子宫螺旋动脉重塑的影响还具有菌株依赖性。Phillips等[19]在P.gingivalis感染的小鼠模型中发现，仅P.gingivalisA7436感染的小鼠出现子宫螺旋动脉重塑不足，而P.gingivalisW83感染组未发现这一表现。

3 P.gingivalis与免疫细胞

在妊娠早期，子宫/蜕膜自然杀伤细胞(uterine/decidual natural killer cells, uNKs/dNKs)是蜕膜间质中的主要细胞，其次有巨噬细胞、中性粒细胞、T细胞等。这些细胞浸润蜕膜并聚集在滋养层细胞周围协助它们正确地侵袭子宫螺旋动脉。

研究发现，在孕早期P.gingivalis能够降低CD56+dNKs的数量并提高CD16+dNKs和CD206+蜕膜巨噬细胞的数量，这种比例的改变可能干扰滋养层细胞迁移和重塑螺旋动脉，并最终导致胎儿发育不良[13]。还有研究发现中性粒细胞在胎盘缺血引起的大鼠高血压中扮演重要角色[20]，目前尚无P.gingivalis与中性粒细胞作用导致APO的直接证据，但有研究发现P.gingivalis的脂多糖能依赖PI3K、JNK和p38MAPK通路诱导中性粒细胞释放抵抗素，而抵抗素与孕妇PE有关[21-22]。另一方面，P.gingivalis的膜泡具有孔蛋白样活性可将中性粒细胞表面的电位去极化，抑制其吞噬作用，这可能是P.gingivalis能够在生殖器官内持续存在的原因之一[23]。

P.gingivalis对CD4+T细胞亚群和相关细胞因子平衡的影响可能也是导致APO的原因之一。文献显示与健康孕妇相比，PE孕妇脐带血中Th2和Treg细胞水平显著降低[24]，血液和胎盘标本中Th1和Th17型细胞因子TNF-α、IL-6的水平显著升高，而Th2型细胞因子IL-4、IL-10水平显著降低[25-26]。早产患者也同样存在类似的现象，且TNF-α、IL-6、IL-10水平与新生儿出生体重呈显著负相关[27]。产生这种变化的原因之一可能是P.gingivalis感染，Lin等[28]发现在小鼠模型中，局部的P.gingivalis感染可以传播到胎盘，并且与胎盘环境由Th2型体液免疫向Th1型细胞免疫的转变以及胎儿生长受限或死亡有关。Ao等[29]发现牙髓感染P.gingivalis的小鼠与对照组相比，血清中TNF-α、IL-6、IL-17、IL-1β(Th1和Th17型细胞因子)水平显著增高，分娩时间显著提前，且在胎盘组织中发现了P.gingivalis存在以及不同程度的胎盘病理性破坏。

4 P.gingivalis、氧化应激和APO

氧化应激(oxidative stress, OS)被认为是活性氧(reactive oxygen species，ROS)的产生和清除作用不平衡导致的，在生理条件下，活性氧能够参与细胞信号通路并促进正常的细胞发育过程，然而病理性的OS状态伴随的局部胎盘组织的ROS和抗氧化剂平衡失调可能与多种不良妊娠反应有关。

OS是牙周炎和系统性疾病相关联的病理生理机制之一，致病菌如P.gingivalis在其中发挥了重要作用，P.gingivalis能够激活某些通路影响靶细胞内线粒体和内质网的功能，造成局部或全身活性氧如过氧化氢(H2O2)、羟基自由基的过量产生。研究发现，牙周炎患者的临床附着丧失越大，血清活性氧代谢物水平越高，该水平与血清的P.gingivalis抗体滴度呈正相关[30]，与牙周健康者相比，牙周炎患者外周血的中性粒细胞OS增强，在P.gingivalis的刺激下产生的过氧化物也显著增多[31]。在体外实验中P.gingivalis的脂多糖还能引起人类牙龈成纤维细胞的线粒体数量增加、活动增强，从而产生大量H2O2进入机体循环内[32]。

目前PE发生的具体分子机制尚不清楚，但是OS被认为在PE患者的内皮功能障碍和系统性血管收缩中起重要作用。一项病例对照研究显示，相较于健康孕妇和未怀孕妇女，PE孕妇的血浆和胎盘组织中抗氧化剂水平显著降低，OS代谢反应显著增强[33]，在早产妇的尿液中也发现8-异前列腺素F2α(OS标志物)显著增高[34]。相关文献显示，ROS可以作为胞内的第二信使刺激胎盘细胞分泌一系列促炎细胞因子，导致广泛性的胎盘血管内皮功能障碍[35-36]。过度的OS状态还能影响胎盘滋养层细胞的凋亡、增殖和迁移行为。例如H2O2是细胞OS级联反应的关键因子，早期PE患者通常伴随循环内H2O2增加，而Murata等[37]的体外研究发现H2O2能促进人类滋养层细胞凋亡并抑制其增殖。研究还发现OS可能通过调节wnt/β-连环素信号通路影响胎盘滋养层细胞的侵袭参与PE发生[38]，结合上文推测，P.gingivalis对人滋养层细胞侵袭能力的影响可能是通过诱导机体的OS状态而产生的。

5 结 论

综上，近年来诸多研究揭示了孕妇APO与牙周炎和P.gingivalis的相关性，这一现象涉及到诸多细胞、细胞因子和信号分子的调节。回顾近年来的相关参考文献，认为P.gingivalis对滋养层细胞侵袭和子宫螺旋动脉重塑的影响是这一过程的关键。P.gingivalis能够以牙菌斑生物膜的形式固定于牙面和牙周组织，也能够通过破溃的牙周袋内壁进入机体循环定植于母胎组织或直接经母体生殖道上行入侵。但无论经由何种方式，孕妇因此而产生的胎盘局部组织或全身OS状态，以及P.gingivalis诱导的滋养层细胞凋亡才是PE、IUGR等APO发生的关键原因。进一步探究该过程中涉及到的具体细胞因子和分子通路将有利于各种APO的预防和治疗。