MicroRNA与舌鳞状细胞癌相关性的研究进展

杨珊珊，朱慧勇

舌鳞状细胞癌(tongue squamous cell carcinoma，TSCC)是口腔颌面部最常见的肿瘤[1]，约占口腔颌面部恶性肿瘤的50%～60%及全身恶性肿瘤的0.8%～2%，每年威胁近50万人的生命[2]。TSCC经常导致患者咀嚼、言语和吞咽功能障碍，其恶性程度较高、侵袭性强、极易发生颈淋巴结转移[3-5]。虽然近些年来肿瘤诊断技术、手术治疗及放化疗水平等已经取得巨大进步，但由于其较高的局部区域复发性和颈部淋巴结转移，与过去的30年相比，患者的预后并没有得到明显提高，TSCC的5年生存率几乎没有变化，这使得TSCC仍然是头颈部最致命的肿瘤类型之一[6-8]。但随着分子生物学的发展，研究发现，MicroRNA在许多生理和病理过程中起着至关重要的作用，包括细胞的发育、增殖、凋亡、侵袭和代谢等[9-10]，它们通过沉默或者抑制癌基因表达等方式，参与到癌细胞生物程序的调控之中[11]。

1 MicroRNA的特点与作用机制

MicroRNA是一类仅有18～25个核苷酸的单链小分子RNA，广泛存在于线虫、果蝇、植物和包括人在内的真核生物中，具有高度的保守性、组织特异性和时序性的非编码RNA分子，不具有开放阅读框(open reading frame)。MicroRNA的基因位于遗传编码基因的内含子中，也有一部分存在于基因间的DNA序列中，形成成熟的MicroRNA后，发挥调控转录后作用。通过完全或不完全碱基互补配对原则与特定靶基因的mRNA的3'或5'UTR区结合，起到抑制mRNA翻译或直接降解特定mRNA的作用[12]。据研究它们可以调节至少60%的人类基因的表达并参与其中，而且几乎所有的生物过程都要通过它们对时间和空间的表达来调控[13]。它们的调节作用涉及到各种疾病的发病机制，包括癌症，在这些疾病中，它们可以作为有效的致癌基因或者肿瘤抑制因子[14-15]。

2 MicroRNAs与TSCC

2.1 MicroRNAs与TSCC发生发展的关系

成熟的MicroRNAs是由初级MicroRNA从Drosha/Dicer家族蛋白连续衍生而来的[16]。在最近的一项研究中发现，与正常的牙龈上皮细胞相比，TSCC细胞系UM-1中Dicer的表达较低，这表明TSCC的致癌过程干扰了MicroRNA的处理[17]。另外，在一项使用硝基喹啉1-氧化物(4NQO)诱导小鼠建立舌癌模型的研究中，发现包括miR-21和miR-31在内的几种MicroRNAs在舌上皮中显示出了与4NQO诱导的上皮发病机制的相类似的反常情况[18]。同时在利用TSCC细胞系、异种移植和临床样本进行的MicroRNA分析实验中表明，各种MicroRNA均有表达异常，提示它们可能参与了TSCC的发病机制[19]。

在众多的MicroRNAs中，miR-21是目前已知的唯一一个在所有目前已经研究过的实体肿瘤中均有表达的MicroRNA。miR-21定位于染色体17q23.2上的空泡膜蛋白基因的3UTR区，众多肿瘤组织中发现该区域表达增强。如在肺癌患者中，发现有66%的患者其miR-21的表达水平至少有2倍以上的上调。在恶性胶质瘤患者细胞中，去除miR-21可以导致半胱天冬酶介导的程序性死亡，这两者均可以支持其作为癌基因作用的观点。在TSCC中，刘长富等[20]通过实时荧光定量PCR检测miR-21的表达，发现降低miR-21的表达后，可以有效地降低舌鳞癌SCC9细胞系的稳定性，增加SCC9的凋亡。此外，有实验重复在瘤腔内注射miR-21抑制剂，发现可显著抑制TSCC异种移植瘤模型的肿瘤生长，它的抑制伴随着细胞增殖和肿瘤血管生成均减少以及诱导细胞凋亡[21-22]，意味着miR-21在TSCC的发展中起着关键作用。研究还发现miR-21的表达与PTEN(磷酸酶和紧张素同源物)和TPM1(原肌球蛋白1)的表达之间存在负相关关系[23]，这是miR-21在其他癌症类型中的两个特征明确的靶点。这些发现证实了miR-21在TSCC中的潜在致癌作用。同时研究分析在舌癌旁组织及舌鳞状细胞癌组织中miR-21以及线粒体凋亡通路相关基因Caspase-3、Caspase-9的表达情况，发现miR-21可能通过调节Caspase-3、Caspase-9线粒体凋亡通道来影响舌鳞状细胞癌的发生发展[24]。

除了具有致癌潜能的miR-21外，其他几个如miR-125b、miR-31、miR-184、miR-24、let-7d和let-7f等在TSCC中也有着密切的联系。新的实验研究已经证实miR-125b在35例TSCC患者中高表达，并与临床分期相关，提示miR-125b表达上调可能参与TSCC的发生发展[25]。在福尔马林固定石蜡包埋的TSCC肿瘤样本中，可以检测到Let-7f显著升高。另外，与配对正常的组织相比，研究发现miR-184在TSCC中的表达上调。miR-184抑制剂通过靶向c-Myc[26]抑制TSCC细胞株CAL27、HN21B和HN96细胞的增殖速率，诱导细胞凋亡。

2.2 MicroRNA可能成为TSCC诊断和预后的标志物

在各种肿瘤类型中均可观察到MicrorRNA表达失调，这使它们成为公认的诊断和预后标志物以及潜在的治疗靶点。在一项MicroRNA分析研究中，假设MicroRNA的表达模式在头颈部区域具有位点特异性，并对扁桃体、舌根和鼻咽部的肿瘤进行了比较。结果发现每个肿瘤在原发部位和淋巴结转移之间都保持着其特有的MicroRNA表达特征[27]。鉴于目前近10%的头颈部转移性鳞状细胞癌的来源不明，利用肿瘤特异性MicroRNA可能会对包括TSCC在内的头颈部肿瘤作出正确的临床诊断提供临床意义。

在最近的一项研究中，TSCC中的一种致癌MicroRNA——miR-424，已被证明在相比起源于牙龈或者口底的肿瘤，优先在TSCC组织中过表达。其在临床正常舌组织中的表达也低于肿瘤舌组织，提示miR-424是舌肿瘤癌变的标志物[28]。miR-21、miR-125b和miR-203也被证实在舌部、牙龈部和口底伴舌部肿瘤中有差异表达，每种肿瘤亚型之间存在相应的差异[29]。实验研究发现miR-21在舌鳞癌组织中高表达，过表达miR-21有效促进了Tca8113细胞的增殖，抑制细胞的凋亡，从而提示miR-21在舌鳞癌诊断和治疗可能具有一定的新型靶点价值[30]。此外,评估11个MircroRNA的表达，这些之前已经被证明在头颈样本中有差异表达，表明miR-21和miR-375在口腔细胞学中可以有效区分TSCC患者和健康对照组的敏感性为100%，特异性为64%[31]。

此外，不同的实验研究中也证实了血浆、口腔细胞学以及唾液中的MicroRNA的诊断能力。在小鼠舌癌模型的组织癌变过程中，同步增加miR-21和miR-31的水平，在唾液和血浆样本中均可明显检测到miR-21、miR-31和miR-146a水平的升高，表明在体液中MicroRNA重建与肿瘤组织有关[18]。在另一项研究中，课题组对TSCC患者和健康对照者唾液样本中MicroRNA进行分析，发现MicroRNA中的miR-139-5p在TSCC患者唾液样本中的表达显著降低，而术后其在唾液中的表达水平又恢复到正常，从而提示miR-139-5p是可以作为舌癌的一种强诊断性的生物标志物[32]。除此之外，我们还在早期舌癌患者的血浆中发现miR-184的表达水平也有自术前明显升高到术后降低至正常水平的明显变化，提示miR-184也可能是TSCC中一个有用的诊断生物标志物[26]。这些发现都对舌癌的早期微创检测和诊断非常有价值。

除了作为诊断标记的潜力，MicroRNA也被认为是TSCC中最强有力的预后评估候选之一。年轻患者侵袭性TSCC中发现了一种独特的let-7家族MicroRNAs表达模式。在同一研究中，除了let-7家族MicroRNAs外，miR-130a-3p、miR-361-5p、miR-99a-5p和miR-29c-3p在侵袭性肿瘤中的表达水平均高于非侵袭性肿瘤样本[33]。癌原性miR-21的表达及低水平的miR-195[34]已被发现是一个独立的预后因子，提示在TSCC中生存不良。miR-26b、miR-375表达的降低也与舌鳞癌的临床分期、淋巴结转移及生存预后显著相关。原发性肿瘤中miR-26表达降低的TSCC患者的平均5年生存率为26.7%，明显低于miR-26b表达升高的患者。miR-375在肿瘤组织中的表达水平与肿瘤大小及患者死亡率呈正相关[35]。除这些外，miR-15b[36]、miR-26a[37]、miR-200b[36]、miR-320a[38]、miR-483[39]、miR-639[40]也均被证明与患者的各种临床和病理特征存在显著相关性。

2.3 与TSCC转移相关的MicroRNA

MicroRNA除了具有致癌和抑癌的特性外，对肿瘤的迁移和侵袭有明确的细胞影响，一些MicroRNA被认为是转移途径中的重要效应因子。

Dicer，编码一种MicroRNA的处理酶，已被证明在舌鳞癌中水平下调。其下调增强了人TSCC细胞的相对迁移和侵袭能力，提示MicroRNA可能参与舌癌的转移[17]。体外探究miR-23b在口腔癌转移中的作用，利用实时荧光定量核酸扩增检测系统(qRT-PCR)检测了miR-23b在口腔正常细胞和口腔癌细胞中的表达差异,结果显示miR-23b在口腔癌细胞中的表达明显高于口腔正常细胞中的表达,且随着口腔癌转移程度的增加而增高，在此基础上,通过给细胞转染miR-23b mimics的方法过表达miR-23b，发现增加口腔原位癌细胞Um-2中miR-23b的表达后，该细胞的转移能力显著增强，表明miR-23b在口腔癌转移中发挥着重要作用，可能成为临床口腔癌的治疗靶点和口腔癌检测标志物[41]。

在最近的一项研究中，将肿瘤芽殖细胞的MicroRNA图谱与成对的中央肿瘤样本进行了比较，发现一种与转移相关的MicroRNA模式。其中，miR-320a的表达下降最为明显，其体外抑制作用促进了TSCC细胞系的迁移和侵袭，说明肿瘤的转移与miR-320a表达降低以及患者生存不良存在相关[38]。TGFb(转化生长因子)诱导TSCC细胞发生上皮-间充质转化(EMT)，导致细胞的MicroRNA谱发生显著差异。miR-639是TGFb处理细胞中最严重下调的MicroRNA之一，在TSCC中被发现通过靶向FOXC1(Forkhead box C1)诱导EMT，说明miR-639的表达降低与转移和患者生存明显相关[40]。此外，在TSCC标本中最常见的过表达MicroRNA是miR-21，它与肿瘤的侵袭模式也密切相关。DKK2(Dickkopf WNT signaling pathway inhibitor 2)是一种参与肿瘤侵袭的拮抗剂，而抑制miR-21可通过上调DKK2导致SCC25细胞侵袭性特征的减弱，这些发现提示miR-21通过靶向Wnt/β-catenin通路增强TSCC肿瘤侵袭能力[42]。但是由于MicroRNA是相互结合而不是单独工作，我们还需要更全面了解MicroRNA在TSCC细胞转移中的作用特征。

2.4 MicroRNA在TSCC耐药和治疗中的作用

我们研究了解各种MicroRNA在舌癌中的作用机制，在特定的组织类型中找到它们的真正目标，并确定精准的表达模式，为开发找到更有效治疗的方法。新的实验研究发现人舌鳞癌耐药细胞株OSC-19/CDDP具有多重耐药的生物学特性，可作为舌鳞癌的顺铂耐药机制及多药耐药机制研究的理想细胞模型。显著差异表达的MicroRNA可能在舌鳞癌耐药的发生、发展中发挥重要作用[43]。到目前为止，有几种MicroRNA已被认为是TSCC的潜在治疗靶点。

在一项研究中发现，在口腔鳞状细胞癌患者的肿瘤标本中，Dicer的低表达与基于5-氟尿嘧啶的放化疗耐药性有关，这表明MicroRNA可能参与调控TSCC细胞的化疗耐药性[44]。研究发现沉默miR-21的表达可以通过靶向PDCD4(程序性细胞死亡4)诱导TSCC细胞对顺铂的敏感性。miR-23a的表达增加可以通过JNK依赖机制触发Twist的表达，诱导TSCC细胞化疗耐药性，降低顺铂诱导的细胞凋亡。另一个靶向MicroRNA——miR-181a的降低伴随着Twist1水平的升高、EMT的诱导和转移潜能的增强，从而在顺铂诱导的TSCC细胞化疗耐药性中发挥作用[45]。顺铂诱导的TSCC细胞凋亡已被证明是由线粒体分裂途径启动的。在这一过程中，miR-483-5p表达降低导致其靶基因FIS1表达升高，FIS1可以调节线粒体分裂和顺铂敏感性[39]。在顺铂诱导的细胞凋亡过程中，BRCA1/miR-593-5p/MFF轴也被解除。顺铂治疗后BRCA1 (Breast Cancer 1)表达降低，使miR-593-5p转活化，通过降低miR-593-5p的表达，增加MFF(线粒体分裂因子)的表达，导致体内外线粒体分裂，MFF是miR-593-5p的直接靶点，由此说明，BRCA1、MiR-593-5p、MFF轴与TSCC耐药及患者生存显著相关[46]。

除此之外，研究还发现顺铂化疗耐药和敏感的舌鳞癌细胞中存在差异表达的线粒体微小RNA(MitomiRs)，特异高表达的MitomiRs：miR-1268a、miR-2392、miR-4462、miR1-290、miR-4449可能在舌鳞癌化疗耐药中具有重要作用[47]。这些发现表明，MicroRNAs在TSCC细胞的化疗耐药和化疗药物的使用中发挥重要作用，特别是某些靶向MicroRNA的治疗药物，比如说下调MicroRNA-17可增强奥沙利铂对口腔癌细胞诱导凋亡作用，从而为口腔癌的治疗提供新思路[48]。

3 结束语

TSCC的发病机制较为复杂，病因至今尚未完全阐明，TSCC患者的5年生存率也没有明显改善。探讨研究TSCC的发病机制，揭开它神秘的面纱，从而寻找更有效的治疗方法，研制更精准的靶向药物，提高TSCC患者的生存率仍是临床上研究的重点。在过去的十年中，无论是作为遗传调控因子还是表观遗传调控因子，MicroRNA在包括TSCC在内的多种癌症中都扮演着重要的角色。但是具体的作用机制并不明确，在TSCC中它们可能是独行侠，也可能同时调控了多个基因通路，还需要更多的临床和实验研究去探索各种MicroRNA在TSCC发病的起始、发展、转移、化疗耐药和复发的潜在分子机制的作用过程，从而为TSCC的早诊断、早治疗提供更广阔的思路，为癌症患者带去新的希望。