褪黑素在牙周炎诊治中的研究进展

杨世缘，胡 月，周宇宁，桂志鹏，徐袁瑾

牙周炎是一种由牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis，P.gingivalis)、福赛坦氏菌和密螺旋体等多种牙周致病菌感染引起的牙周支持组织炎症。根据2018年第四次全国口腔流行病学调查结果显示，牙周炎在我国中老年人群中发病率很高，其中35～44岁年龄组、55～64岁年龄组、65～74岁年龄组附着丧失(≥4 mm)的检出率分别为33.2%、69.9%、74.2%[1]。近年来，大量研究发现牙周炎可增加诸多疾病(如动脉粥样硬化、不良妊娠结局、类风湿性关节炎、误吸性肺炎和癌症)发生的风险，影响患者的全身健康[2]。因此，预防和治疗牙周炎对于全身健康至关重要。在减少致病菌、控制牙周炎发展的基础上重建牙周骨组织是牙周炎治疗的关键。传统的牙周缺损修复手段如骨移植和引导性组织再生通常无法实现完全再生已破坏的牙周骨组织[3]。组织工程的出现和迅速发展，被认为是实现牙周骨组织再生的理想方法。

近年来，大量研究发现褪黑素在唾液中的浓度与牙周炎的严重程度密切相关，同时还发现褪黑素具有抑菌、抗炎、抗氧化、免疫调节和促进骨再生等特性，为牙周炎的诊断及治疗研究拓宽了思路[4-5]。本文对褪黑素在牙周炎中发挥的作用及其机制的相关研究进行总结，并着重分析褪黑素应用在牙周骨组织工程领域的潜力，拟为今后治疗牙周炎寻找新的有效治疗靶点提供重要基础。

1 褪黑素

褪黑素(N-乙酰基-5-甲氧基色胺)是一种内源性吲哚类激素(分子量为232.3)，存在于细菌、真菌、扁虫、软体动物、海星、昆虫、酵母、植物、鱼、两栖动物、爬行动物、鸟类和哺乳动物等众多生物中。在脊椎动物中，褪黑素除了由神经内分泌器官(松果体)集中产生外，还可在视网膜、肠、皮肤等其他部位少量合成[6]。褪黑素具有很高的脂溶性和水溶性，可通过受体依赖性途径和非受体依赖性途径参与调节众多生理功能，如控制昼夜节律、调节体温、调节性发育和生殖周期以及活化免疫系统等[7-8]。褪黑素受体包括膜受体和核受体两类。褪黑素膜受体属于G蛋白偶联受体家族，包括两种哺乳动物亚型，褪黑素受体1型(melatonin receptor 1，MT1)和褪黑素受体2型(melatonin receptor 2，MT2)，分别由350和363个氨基酸残基组成，具有高度的序列同源性，都能以高亲和力与褪黑素结合。褪黑素核受体维甲酸Z受体(retinoid Z receptor，RZR)/维甲酸相关孤核受体(retinoic acid-related orphan receptor，ROR)包括3个亚型(α，β，γ)和4个α-亚型剪接变体，其中仅RORα亚型的剪接变体c和RORγ亚型与核中褪黑素作用有关[6]。而褪黑素的非受体依赖途径是通过清除自由基发挥直接抗氧化作用以及诱导抗氧化酶间接抗氧化而实现的[9]。

2 唾液褪黑素与牙周炎的相关性

口腔中的内源性褪黑素，来自体循环中未与血清白蛋白结合的褪黑素。唾液中的褪黑素含量是血液循环中褪黑素含量的1/4～1/3，白天的浓度为1～5 pg/mL，午夜高峰时的浓度可达到50 pg/mL[10]。Shimozuma等[11]发现褪黑素生物合成中介导5-羟色胺向褪黑素转化的关键酶在啮齿类动物的唾液腺和人下颌下腺中也有表达，这表明褪黑素也可以在这些组织中局部合成。同时，还有研究报道MT1和MT2受体在口腔上皮细胞、黏膜固有层的成纤维细胞、上颌牙槽骨的成骨细胞、唾液腺导管细胞和腺泡细胞中存在[12]。

近年来，许多人认为唾液褪黑素水平可以作为诊断牙周炎的生物标志物，并进行相关研究。Cutando等[13]检测37例牙周患者的唾液和血浆褪黑素水平，发现社区牙周指数 (community periodontal index，CPI)评分越高的患者，唾液褪黑素水平和唾液/血浆褪黑素比越低。Almughrabi等[14]则对健康受试者、菌斑性牙龈炎患者、慢性牙周炎患者和侵袭性牙周炎患者龈沟液和唾液中的褪黑素浓度进行了检测，发现龈沟液和唾液中的褪黑素浓度在健康组和菌斑性牙龈炎组较高，在慢性牙周炎组和侵袭性牙周炎组明显降低，但在慢性牙周炎组和侵袭性牙周炎组之间没有统计学上的差异，因此认为褪黑素可能对牙周组织具有保护作用。Bertl等[15]发现在牙周非手术治疗(nonsurgical periodontal therapy，NSPT)前，牙周炎患者的唾液褪黑素水平低于健康对照组，而在NSPT后，牙周炎患者唾液中降低的褪黑素水平有所恢复，其恢复的程度与牙周局部炎症的减轻呈显著正相关。然而，也有相反的研究结果。Lodhi等[16]选取30例受试者，发现牙周炎组中唾液褪黑素浓度最高，其次是牙龈炎组，健康组最低。此外，还有研究发现，在糖尿病(diabetes mellitus，DM)和非DM患者中，血浆和唾液中的褪黑素浓度与CPI呈现出双相关系，即在CPI评分为0～2时，随CPI指数增大褪黑素浓度降低；在CPI评分为2～4时，随CPI增大褪黑素浓度升高，并在CPI评分为4时褪黑素浓度达到顶峰[17-18]。

3 褪黑素改善牙周状态的机制

3.1 褪黑素的抑菌作用

牙周炎的发生与生物膜中的菌群失调有关。P.gingivalis是一种革兰阴性口腔厌氧菌，在牙周炎患者的龈下菌斑中有较高的检出率，是目前公认的牙周炎主要致病菌之一。P.gingivalis可通过多种途径参与牙周炎发病过程，包括释放牙龈蛋白酶K(gingipain K，Kgp)、牙龈蛋白酶R(gingipain R，Rgp)等细胞外蛋白水解酶促进宿主蛋白降解，产生溶血素促进红细胞释放血红素，凭借细胞壁组分P.gingivalis来源的脂多糖(Porphyromonasgingivalis-derivedlipopolysaccharide，P.g-LPS)刺激宿主细胞产生白细胞介素(interleukin，IL)等。Zhou等[5]发现褪黑素对P.gingivalis不仅具有体外抗菌活性，还能降低其Kgp和Rgp的表达、抑制其溶血活性以及减少P.g-LPS刺激的人牙龈成纤维细胞IL-6和IL-8的释放。

3.2 褪黑素的抗炎、抗氧化作用

牙周支持组织的破坏在很大程度上是由于宿主持续释放促炎细胞因子、自由基和活性氧(reactive oxygen species，ROS)导致的。近年来，有大量研究表明褪黑素可以抑制促炎细胞因子的释放，减轻氧化应激损伤，有效改善牙周健康。Kara等[19]发现褪黑素可降低实验性牙周炎大鼠血清中炎症因子IL-1β、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)的水平和减轻氧化应激损伤。Virto等[20]发现褪黑素辅助治疗牙周炎伴肥胖大鼠时，有效降低了牙龈组织中促炎细胞因子IL-1β、IL-6、单核细胞趋化蛋白-1和TNF-α的水平，可有效控制牙周炎症并显著减少牙槽骨吸收。Kose等[21]发现全身性褪黑素治疗伴或不伴DM的实验性牙周炎大鼠时，可显著降低实验性牙周炎大鼠牙龈组织中髓过氧化物酶和血清中氧化应激指数水平。此外，在接受NSPT处理的2型DM的慢性牙周炎患者中，褪黑素补充治疗可显著下调患者血清中的炎症指标TNF-α、IL-6，上调抗氧化指标超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶，有效改善牙周状态[22-23]。

3.3 褪黑素的免疫调节作用

牙周炎的组织破坏与宿主对牙菌斑生物膜中微生物产生的免疫应答关系密切，因此，调节宿主免疫应答，减少免疫应答给机体带来的损害对牙周炎的治疗至关重要[24]。近年来，许多临床证据显示中性粒细胞与牙周组织破坏密切相关，且其数量与牙周炎的严重程度呈正相关[25]。Kose等[21]发现褪黑素能减少实验性牙周炎大鼠下颌骨中性粒细胞的浸润。巨噬细胞作为牙周组织中免疫应答的第一道防线，一方面通过发挥防御功能维持牙周组织稳态，另一方面通过分泌IL-1和一氧化氮(nitric oxide，NO)等物质导致牙周组织的破坏，加重牙周炎[26]。Choi等[27]发现褪黑素能通过抑制STAT1途径减少中间普氏菌来源的脂多糖诱导的鼠巨噬细胞产生IL-6和NO。以上研究均提示褪黑素可能成为牙周炎宿主调节治疗的有效药物。

4 褪黑素与牙周骨组织再生

近年兴起的组织工程旨在通过单独或组合使用支架材料、种子细胞、外源性因子(化学或生物)修复受损的组织，获得高效、可预期的牙周骨再生。间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)作为一种理想的种子细胞，目前被广泛应用在牙周组织缺损修复中。支架材料可以以接种或不接种离体细胞的形式掺入骨缺损部位以促进骨形成[28]。外源性化学因子通过各种方法被添加到支架材料上产生生物活性，以加快再生过程。褪黑素作为一种具有抗菌、抗炎和抗氧化作用的外源性化学因子，其结合MSCs和/或支架材料促进骨再生的作用已在许多研究中得到报道，有望应用在牙周骨组织工程领域中[4]。

4.1 褪黑素与MSCs

4.1.1 褪黑素促进生理状态下MSCs成骨分化 2006年，Radio等[29]发现褪黑素通过上调MT2和激活丝裂原活化的细胞外信号调节激酶1/2(mitogen-activated extracellular signal-regulated kinase 1/2，MEK 1/2)/细胞外信号调节激酶1/2(extracellular regulated protein kinases 1/2，ERK1/2)信号通路，在一定程度上提高了人间充质干细胞(human mesenchymal stem cells，hMSCs)中碱性磷酸酶的表达水平。Sethi等[30]发现褪黑素加入的时间点会影响hMSCs的分化，在成骨的起始或最终阶段加入可提高细胞的分化率，而中间阶段加入则不影响结果。Lee等[31]发现褪黑素以剂量依赖的方式激活腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate-activated protein kinase，AMPK)从而促进hMSCs的成骨分化。Rafat等[32]证明褪黑素预处理骨髓来源的间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs)可促进其成骨分化并抑制其凋亡。Zhou等[33]研究表明褪黑素通过抑制MT2依赖的核转录因子κB (nuclear transcription factor kappa B, NF-κB)信号通路显著加速BMSCs的成骨分化。Jiang等[34]发现褪黑素可通过激活AMPK/β-catenin信号通路协同骨形态发生蛋白-9 (bone morphogenetic protein-9，BMP-9)促进MSCs成骨分化。Li等[35]发现褪黑素通过上调miR-92b-5p的表达，靶向沉默细胞间粘附分子-1 (intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)的表达来促进BMSCs的成骨分化。

4.1.2 褪黑素恢复病理状态下MSCs成骨分化的能力 褪黑素不仅能促进生理状态下MSCs的成骨分化，还能恢复病理状态下MSCs被抑制的成骨分化能力。H2O2和铁超载的微环境导致BMSCs成骨分化能力降低，褪黑素分别通过上调沉默信息调节因子1(silent information regulator 1，SIRT1)表达和阻断p53/ERK/p38信号通路来恢复BMSCs的分化能力[30, 36-37]。此外，还有研究报道褪黑素可恢复被镉抑制的hMSCs成骨分化能力[38]。褪黑素治疗去卵巢大鼠时，其有明显的抗骨质疏松作用，并能保持BMSCs成骨分化潜能[39]。有学者发现用褪黑素处理青春期特发性脊柱侧凸患者来源的hMSCs后，能上调其与成骨分化有关基因的表达，并通过上调软脂酰化磷蛋白4，激活MEK1/2/ERK1/2信号通路促进其成骨分化[40-41]。另外，还有研究发现褪黑素可通过上调Yes相关蛋白的表达和减少ROS的产生恢复BMSCs被TNF-α抑制的成骨分化能力[42-43]。

4.1.3 褪黑素与牙周膜干细胞 在牙周膜组织中，有一群称为牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells，PDLSCs)的MSCs，其能分化为成骨细胞、成牙骨质细胞、成胶原细胞和成脂肪细胞，被认为是牙周骨组织工程中最有潜力的种子细胞[44-45]。Otero等[46]证明在杜氏改良Eagle培养基中添加50 μmol/L褪黑素能促进PDLSCs成骨分化。Zheng等[47]研究表明，在生理浓度(1 pmol/L～10 nmol/L)下，褪黑素抑制了PDLSCs中成骨相关基因的表达；在药理学浓度(1 μmol/L～1 mmol/L)下，褪黑素促进了PDLSCs的成骨分化。

4.2 褪黑素与支架材料

外源性添加褪黑素促进成骨作用已在许多研究中得到报道[4]。支架材料作为牙周骨组织工程中一个关键要素，可提供一个有利于种子细胞粘附、增殖、分化及生长的三维支架式外环境，同时也可作为外源性化学因子的载体。支架材料可分为天然衍生材料、人工合成材料和复合材料三大类。

4.2.1 天然衍生材料 天然衍生材料指的是自然界形成的或来源于自然界的有机材料(胶原、壳聚糖、藻酸盐)和无机材料(天然骨、珊瑚材料)。因猪的基因型与人类相似，天然来源的猪骨常被用于骨再生[48]。有学者将褪黑素与猪骨充填在比格犬下颌骨种植体周围缝隙中，进行3个月的随访，研究发现，褪黑素和猪骨联合使用与单独使用猪骨相比，种植体和骨的整合明显增强，种植体周围区域骨生长及血管和结缔组织的形成增加，而牙槽嵴顶的吸收减少[49]。还有研究发现，在向兔胫骨近干骺端植入猪骨植入物后的2个月内，添加褪黑素的植入物附近皮质骨再生快于不添加褪黑素的对照组[50]。

4.2.2 人工合成材料 人工合成材料是指由人工合成的材料，分为有机(聚己内酯、聚乳酸-羟基乙酸共聚物)和无机(铝酸钙、合金)两大类。

聚己内酯(polycaprolactone，PCL)因其廉价、降解缓慢、机械性能理想等优点被广泛应用于组织工程中。Gurler等[51]用电喷雾法将褪黑素负载在PCL微粒上置入大鼠颅骨缺损处，发现其能明显促进缺损处骨再生。聚乳酸-羟基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA)是一种具有良好生物相容性、机械强度和可降解性的高分子聚合物，已经被广泛应用在缓控释给药系统的研究中。Zhang等[52]用PLGA微球包封褪黑素，使其成为一种褪黑素缓释系统，该缓释系统可以在一段时间内产生具有相对稳定浓度的褪黑素微环境，并能促进MSCs在体外的成骨分化。β-环糊精呈外亲水、内疏水的特征结构，近年来常将许多疏水性化合物封装到其空腔中以改善化合物的水溶性。Terauchi等[53]将褪黑素与2-羟丙基-β-环糊精制备形成包合物，改善了褪黑素的水溶性并在体外显著增强了MC3T3-E1细胞的成骨分化能力。

铝酸钙(calcium aluminate，CA)作为一种合成无机陶瓷，具有低毒性和良好的机械强度，被认为是理想的合成骨替代物。Clafshenkel等[54]发现与CA支架相比，CA-褪黑素支架显著促进了人成骨细胞的增殖、存活和粘附。由于钛合金具有与天然骨接近的弹性模量和良好的骨传导性，近年来作为支架材料或作为支架材料表面涂层广泛应用在骨组织工程中，但使用过程中磨损的钛颗粒会导致周围骨溶解[55]。Ping等[56]发现褪黑素可抑制钛颗粒诱导的溶骨并促进溶骨部位的骨形成，并证明了褪黑素是通过Wnt/β-catenin信号途径抑制钛颗粒诱导的破骨细胞生成，减轻MSCs成骨分化抑制作用。此外，还有研究发现用塑料帽状支架引导大鼠颅骨缺损处骨再生时，添加褪黑素明显增加支架上新骨的形成，且垂直骨生成明显增加[57]。

4.2.3 复合材料 复合材料是指由两种或两种以上不同性质的材料，通过物理或化学的方法，在宏观或微观上组成具有新性能的材料。最近，Lai等[58]用直接滴加法和自旋辅助技术制备了负载褪黑素的壳聚糖/明胶多层涂层TiO2纳米管，并测定该涂层能有效持续释放褪黑素，与未负载褪黑素TiO2纳米管相比能有效促进MSCs粘附、扩散、增殖和成骨分化。Liu等[59]则设计了一种双相水凝胶，该水凝胶由两个结合良好形状可调的水凝胶相组成，分别称为骨再生水凝胶(bone-regenerating hydrogel，BRH)和软骨再生水凝胶(cartilage-regenerating hydrogel，CRH)，BRH和CRH中的纳米盒(β-环糊精)分别装载了成骨和成软骨分化诱导剂(褪黑素和卡托基宁)，发现药物和凝胶的联合使用比单独使用凝胶更能有效促进骨再生和软骨再生。

5 结 论

牙周炎作为一种主要的口腔疾病，会导致牙龈退缩和牙槽骨吸收[60]。牙周炎早期多无明显自觉症状，常常在接受检测和治疗之前，牙周炎已达到严重程度。因此，早期诊断和治疗对牙周炎至关重要。唾液褪黑素浓度有望用于牙周炎临床诊断，但牙周状态与唾液褪黑素浓度之间的关系尚无明确定论，还有待进一步探索[13-18]。此外，还有大量研究表明外源性添加褪黑素可改善牙周炎牙周状态，但具体机制尚不清楚[19-23]。

褪黑素能促进MSCs成骨分化并与不同支架材料联合使用明显促进骨再生，显示出其在牙周骨组织工程领域的巨大潜力，但目前研究仍存在如下问题：①褪黑素对牙周骨组织工程中理想的种子细胞PDLSCs的影响仍不明确；②与何种支架联合使用才能实现褪黑素在局部的长期缓释。综上所述，要实现褪黑素在牙周炎诊治和牙周骨组织工程中的临床应用，还需要研究者们不断探索和完善。