骨髓间充质干细胞生物学特性的影响因素：供体年龄和体外扩增

2021-11-30田小荣宋红丽天津医科大学一中心临床学院天津3009天津市第一中心医院器官移植科天津市器官移植重点实验室天津市器官移植临床医学研究中心卫生部危重病急救医学重点实验室中国医学科学院移植医学重点实验室天津3009

实用器官移植电子杂志 2021年6期

田小荣，宋红丽（. 天津医科大学一中心临床学院，天津 3009 ；. 天津市第一中心医院器官移植科，天津市器官移植重点实验室，天津市器官移植临床医学研究中心，卫生部危重病急救医学重点实验室，中国医学科学院移植医学重点实验室，天津3009）

1970 年，Friedenstein 教授第一次从骨髓中分离出具有在体外以克隆集落形式快速生长能力的贴壁的成纤维样细胞［1］。1991 年，Caplan 提出“间充质干细胞”这个术语［2］。而2006 年，国际细胞治疗学会才正式提出了定义人类间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）的基本标准：① 在标准培养条件下，必须具有塑料黏附性；② 表面分子CD73、CD90 和CD105 阳性；并缺乏表面分子CD45、CD34、CD14、CD11b、CD79α 或CD19 和HLA-DR；③ 在体外具有分化为成骨细胞、成脂肪细胞、成软骨细胞的能力［3］。其被广泛应用于再生医学、肿瘤学、移植学等领域，用于治疗移植物抗宿主病、克罗恩病、多发性硬化症、肝脏移植、肌腱愈合等多种疾病。MSCs 可以来源于骨髓、脂肪组织、牙髓、脐带等多种组织。骨髓是第一个分离出MSCs 的组织［1］，与脐带源性MSCs 和脂肪组织源性MSCs 相比，骨髓间充质干细胞（bone marrow derived mesenchymal stem cells，BMMSCs）具有更高的移植物移植率［4-6］。BMMSCs 的分离技术以及研究较为成熟，故本篇综述主要阐述对象为BMMSCs。BMMSCs 生物学特性包括其形态学、免疫表型、增殖能力、多向分化潜能及免疫调节能力等，选择什么状态的BMMSCs 在医学应用上能最大程度地发挥其特性成为人们关注的问题。研究表明，衰老会影响细胞的生物学特性，骨髓中所含的MSCs 数量极低，约为0.001% ～ 0.01%［7］，获得足量的BMMSCs，体外扩增是必不可少的。供体的年龄、BMMSCs 连续体外扩增均会导致细胞的衰老，使其生物学特性发生变化，进而影响其应用。

1 供体年龄和体外扩增对BMMSCs 生物学特性的影响

1.1 供体年龄和体外扩增对BMMSCs 细胞形态、衰老标志物、细胞免疫表型、细胞周期、增殖能力的影响：当BMMSCs 衰老时，其形态、表型、细胞周期、增殖能力等都会发生变化。从骨髓中分离出来的MSCs 的生物学特性与供者的年龄密切相关。在老年个体中发现BMMSCs 数量和功能随年龄而下降［8］。衰老供体相比于年轻供体来源的BMMSCs，其形态扁平、增大，胞质颗粒状［9］。Ma 等［10］观察到老年（16 月龄）小鼠比年轻（3 月龄）小鼠来源的BMMSCs 的衰老相关的β 半乳糖苷酶（Senescence-associated β-galactosidase，SA-β-gal）阳性细胞的数量更多，p53、p21 和p16 在蛋白水平上也显著升高。Chen 等［11］观察到随着年龄的增长（15 ～ 85 岁），人骨髓间充质干细胞（human bone marrow MSCs，hBMSCs）SA-β-gal阳性细胞数量明显增加，细胞周期分布阻滞在G0/G1 期, S 期所占比例随着年龄的增长而减少。随着年龄的增长BMMSCs 的增殖能力也会下降［11］。

BMMSCs 体外连续扩增会发生衰老［9］。Izadpanah 等［12］研究表明，在早期传代中，hBMSC的细胞增殖率约为48 h。在第10 代（10 passages，P10）后，细胞的增殖效率稳步下降。至少在P10之前hBMSC 保留了其高水平的端粒酶活性和长端粒长度。hBMSCs 在P15 显示出扩大、扁平的细胞形态，此后他们停止进行细胞分裂，但仍保持存活。在P20， hBMSCs 经历了周期阻滞，端粒酶活性显著降低。大鼠的BMMSCs 成纤维细胞样形态维持了7 ～ 10 代。渐渐地，衰老细胞的增殖速度明显减缓，凋亡率增加，最终失去对底物的黏附［13］。hBMSCs早期传代的表面抗原检测水平比晚期传代要高得多，如CD146+的细胞数量随着体外扩增而下降［9］。大鼠BMMSCs 连续传代后细胞的表面抗原如CD90、CD44 和CD29 表达水平逐渐降低（P3 ＞P6 ＞P9）［13］。这些结果表明，BMMSCs 的诱导能力降低了。在hBMSCs P4、P7 和P14 中，SA -β- gal 活性逐渐增高，而端粒长度逐渐减少，表明hBMSCs 在传代过程中衰老细胞的比例逐渐增加［14］。有研究表明大鼠BMMSCs P2 至P4 的BMMSCs 增殖潜能最高［13］。Konala 等［15］观察到hBMSC 晚期传代（P9）比早期传代（P3）克隆集落形成单位数目降低，即增殖能力下降。P9 比P3 的G0/G1 期的细胞比例略有下降而SA -β- gal 阳性的细胞比例增加，说明衰老细胞的百分比随着传代次数的增加而增加。这些结果证实了晚期传代的BMMSCs 活跃性和增殖能力下降。

1.2 供体年龄和体外扩增对BMMSCs 分化潜能的影响：随着供体年龄增长，BMMSCs 向成骨细胞、软骨细胞分化的能力越低，向成脂细胞分化的能力越强。老年小鼠来源的BMMSCs 比年轻小鼠来源的BMMSCs 成骨、成软骨能力降低，而成脂能力增强［10，16］。但有研究也发现来自老年供体小鼠的BMMSCs 成脂潜能下降［16］。这与多数文献结果不同，可能与供体、实验室条件、培养方法等不同有关。Li 等［13］发现诱导2、6 和12 周龄，以及10 月龄SD 大鼠的BMMSCs 成骨分化，2 周龄组BMMSCs矿化结节明显，骨钙素浓度显著高于其他各组，但与6 周龄组骨钙素水平差异无统计学意义。10 月龄组BMMSCs 骨含量明显减少，矿化结节明显减少，其骨钙素整体水平明显低于其他各组。2 周龄和6 周龄供体SD 大鼠的细胞显示出明显增加的碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性，这与12 周龄和10 月龄动物的细胞相比，与骨含量增加和矿化结节强阳性染色相一致。10 月龄供体的BMMSCs 的ALP 活性最低，骨含量和矿化结节形成减少，表明这些细胞丧失了成骨分化能力。

Karaöz 等［17］对大鼠BMMSCs 的P3、P50、P100进行研究，发现在传代后期，成脂标志物——重组人过氧化物酶体增殖物激活受体γ 的表达显著降低，这表明在长期培养过程中大鼠BMMSCs 的成脂分化能力降低。BMP-2、Coll1、Coll2、骨连接素、骨钙素和Runx2、神经标记物TUBB3 水平、软骨形成标记物SOX9 水平在长期传代中均被检测到降低，有些指标在P100 中降低最为明显。hBMSCs 在早期传代中，成骨分化的菌落比例为50%～65 %。然而，这一频率在P30 时下降至30% ～ 35%。在P10及以上培养时，hBMSCs 的脂肪生成频率显著降低。随着传代数的增加，成脂肪分化的集落占整个细胞群的比例下降。hBMSCs 在P1 均表现出向软骨细胞分化的潜能。在P5 及更高代时，hBMSCs 迅速丧失了软骨分化潜能［18］，而有研究则表明hBMSCs 至少在P10 之前保留了其多谱系分化的潜能［12］。大鼠BMMSCs体外培养时P3与P7均具有成骨、成脂能力，但是P7 的分化潜能比P3 小，到P9 时可能已失去多向分化潜能［19］。

1.3 供体年龄和体外扩增对BMMSCs 免疫调节的影响：BMMSCs 对T 淋巴细胞、B 淋巴细胞、NK 细胞、DC 细胞的增殖均有调节作用［20-23］。其免疫抑制功能通过Notch 信号和HLA-G 等介导与免疫细胞直接接触，或通过分泌白介素-10（interleukin-10，IL-10）、肝细胞生长因子、IL-6、前列腺素E2、吲哚胺2，3 -双加氧酶等相关免疫调节因子发挥作用。

BMMSCs 可抑制T 细胞的激活和增殖。与T 细胞共培养后BMMSCs 的IL-10 和转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）基因表达显著增强。BMMSCs 抑制T 细胞可通过接触依赖诱导T 细胞抑制特性的调节性抗原提呈细胞间接抑制T细胞［24］、通过HLA 作用于原发性和继发性反应及外泌体作用抑制T 细胞［22］。

BMMCs 抑制脂多糖活化的B 淋巴细胞增殖并抑制活化的B 淋巴细胞分泌IgG、IgM 和IgA。但BMMCs 不能诱导B 淋巴细胞凋亡［25-26］。

BMMSCs 抑制DC 分化过程中CD1a、CD40、CD80、CD86 和HLA-DR 的上调，并阻止DC 成熟过程中CD40、CD86 和CD83 表达的增加。BMMSCs上清液对DC 的分化没有影响，但在成熟过程中抑制了CD83 的上调。BMMSCs 及其上清液均干扰了DC 的内吞作用，降低了其分泌IL-12 和激活异反应性T 细胞的能力［23，27］。在接触和Transwell 系统中，BMMSCs 抑制NK 细胞增殖，也抑制NK 细胞分泌γ-干扰素（interferoninterferon，IFN-γ）、IL-10、以及TNF-α，但不诱导细胞死亡［28］。

来自老年供体的BMMSCs 抑制T 细胞增殖的能力降低，而Siegel 等［29］分析了53 例年龄在13 ～80 岁的捐赠者，结果表明年龄和T 细胞抑制能力之间没有显著的相关性，这与供者年龄对BMMSCs 抑制T 细胞增殖有负面影响的论断相矛盾［30］。

BMMSCs 在所有传代中均高分泌TGF-β1，IL-4 水平略有升高，但不显著； P6 中IL-6 水平比P4 明显升高。随着不断的传代，肿瘤坏死因子诱导蛋白6、HLA-G 的表达均降低。半乳糖凝集素-1 和半乳糖凝集素-3 的表达均增加。在所有传代中，TNF-α、IFN-γ、IL-1β 和IL-4 的水平都很低，IL-10 水平相似，TGF-β1 水平都很高［29］。El-Sayed 等［32］对小鼠来源的BMMSCs 研究表明，BMMSCs 抑制CD8 的表达。与早期传代的BMMSCs（P1）相比，晚期传代的BMMSCs（P6）释放的TGF-β 较少。然而，在早期和晚期传代的BMMSCs中，IL-6 的表达水平相当。其他研究也表明，脐带MSCs 随体外扩增代数增加而逐渐衰老，但免疫抑制能力逐渐加强［33］,也有研究表明BMMSCs 随体外扩增代数增加其免疫抑制能力降低［34］。

1.4 推荐使用的供体年龄及体外扩增代数：供体年龄的增长限制BMMSCs 更好地应用，根据前面所述在选择供体来源时尽量选择年轻的供体。综合BMMSCs 不同生物学特点的分析，我们建议最好选6 周龄之内的鼠类作为BMMSCs 的供体来源；于hBMSCs 而言则尽量选择成年之前的供体作为BMMSCs 的来源。

连续体外扩增，BMMSCs 会发生衰老，进而影响其形态、增殖能力、分化潜能、免疫调节等特性，所以选择合适传代数是非常重要的。对于hBMSCs，我们建议选择P2-P6 或P8 的BMMSCs［35-36］；而鼠源性的BMMSCs，我们建议选择P2-P6 的BMMSCs。但是关于MSCs 是否在传代过程中保持免疫调节特性的信息较少［31］，如何平衡其他生物学特性与免疫调节特性进而选择合适的传代数仍有待进一步研究。

2 抗BMMSCs 衰老方法初探寻

BMMSCs 的应用广泛，但是其衰老问题成为大家关注的焦点。如何延缓或者改善BMMSCs 衰老也成为了这些年研究的热点。巨噬细胞迁移抑制因子，是一种促炎细胞因子，可调节年龄相关信号通路。其通过与CD74 相互作用，进而激活AMPKFOXO3a 信号通路，使BMMSCs 从年龄诱导的衰老状态恢复活力［37］。褪黑激素对P1、P4 BMMSCs 的集落形成、增殖和成骨分化没有影响，但在很大程度上阻止了P15 BMMSCs 的自我更新和分化能力的下降。褪黑素通过激活抗氧化防御系统，抑制细胞衰老途径，保留控制干细胞特性基因的表达，能有效地预防BMMSCs 长期传代后的功能障碍和治疗失败［38］。Fei 等［39］研究表明，老年BMMSCs 乙酰化水平和KAT6A 表达降低，下调KAT6A 导致老年BMMSCs 增殖、集落形成和成骨分化减少。发现KAT6A 可以调节Nrf2/ARE 信号通路，抑制骨髓间充质干细胞中活性氧的积累，从而促进老年BMMSCs 增殖、集落形成、成骨及成骨分化。

研究者们从细胞因子、作用因素及信号通路等多个方面探寻抗BMMSCs 衰老的方法，其仍有待于我们进一步探索，这将非常有利于BMMSCs 的治疗和研究应用。