耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌的耐药机制研究进展

马亚楠 王素梅 张健东

天津市第三中心医院检验科 300170

鲍曼不动杆菌是一种非发酵革兰阴性杆菌，为条件致病菌，是引发院内感染主要病原菌之一。碳青霉烯类抗生素是抗菌谱最广，抗菌活性最强的非典型β-内酰胺抗生素，是鲍曼不动杆菌感染治疗的主要药物。近年来，由于该类药物的广泛使用，碳青霉烯类药物的耐药形势严峻。CHINET中国细菌耐药监测网数据显示，鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类的耐药率由2005年的31.0%逐渐上升到2014年的66.7%[1]。鲍曼不动杆菌碳青霉烯类耐药株逐年增加，且多重耐药、广泛耐药和全耐药不断出现，如不加以控制，临床上将无药可治。面临耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌(Cabapenem resistant acinetobacter baumannii,CRAB)在我国范围内的爆发流行，探究CRAB的耐药机制，为临床鲍曼不动杆菌感染的快速诊断、合理用药和感染控制方面提供重要的理论基础。

1 碳青霉烯酶的产生

碳青霉烯酶是一种能水解大多数青霉素、亚胺培南与美罗培南等药物的β-内酰胺酶，分为A、B、D 3种类型。碳青霉烯酶有较为广泛的水解范围，能破坏亚胺培南或美罗培南等抗菌药物中的β-内酰胺环，导致环内的酰胺键断裂，从而使抗菌药物的活性消失[2]。与鲍曼不动杆菌产生耐药性有关的主要碳青霉烯酶可分为两大类，分别是B类金属β-内酰胺酶和D类苯唑西林酶。

B类金属β-内酰胺酶在鲍曼不动杆菌中检出较少。主要包括IMP、VIM、SIM、NDM 4型，其中NDM型金属β-内酰胺酶普遍存在于肠杆菌科细菌中，但相关实验数据表明我国不动杆菌NDM酶的携带率呈明显上升趋势，需引起相关重视[3]。IMP酶具有地方流行性，日本一项研究发现由金属β-内酰胺酶引起的血流感染分离出的菌株，都含有IMP-1，并携带blaIMP-1基因与多重抗生素基因[4]。VIM酶的携带率仅次于IPM酶，主要存在于革兰阴性菌中。研究表明，多氯联苯能够通过改变blaVIM的表达来增强革兰阴性菌对美罗培南的敏感性[5]。

D类苯唑西林酶(Oxacillinase，OXA)为不动杆菌所特有，主要通过降低外膜蛋白的表达和(或)增强外排系统来发挥其耐药性。主要包括OXA-23、OXA-24、OXA-51、OXA-58等多种亚型。其中亚型OXA-23在CRAB携带率阳性最高，在我国可高达80%以上。BlaOXA-23基因可以插入染色体与质粒中，经质粒进行传播感染，是造成CRAB暴发流行的主要原因[6]。OXA-51基因是鲍曼不动杆菌的固有基因，在鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类药物的耐药性中也起到关键作用。目前实验室采用荧光PCR的方法检测鲍曼不动杆菌固有基因OXA-51基因和鲍曼不动杆菌耐碳青霉烯类抗生素基因OXA-23基因，在CRAB的快速检测中发挥着重要的作用。OXA-24和OXA-58的携带率较低，国内相关的报道较少。

2 外膜蛋白的缺失或改变

鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类药物的耐药机制复杂，外膜蛋白的缺失或改变是CRAB形成的重要机制之一。正常状态下，细菌外膜表面覆盖有高度选择性的膜孔蛋白，聚集成孔道，药物通过孔道进入并发挥药效。当外膜蛋白基因发生改变时，孔道便会发生阻塞甚至消失，阻碍药物进入细菌，细菌的耐药性增强。

外膜蛋白A(Outer membrane protein A，Omp A)是革兰阴性菌外膜蛋白的主要组成部分，是介导细菌生物膜形成、真核细胞感染、抗生素耐药性和免疫调节的关键毒力因子。研究发现Omp A对鲍曼不动杆菌的耐药性起重要作用，它不仅可以改变细胞外膜的通透性、抗生素结合靶位并促进生物膜形成，还能结合宿主细胞表面的特定成分侵入最终导致靶细胞凋亡[7]。国外学者发现编码对碳青霉烯类药物有选择性的孔蛋白的基因OprD2编码基因的缺失与插入片段突变会使孔蛋白变性，导致进入菌体的抗菌药达不到有效作用浓度，从而增加菌体耐药性[8]。

3 主动外排系统的过度表达

耐药结节分化家族(Resistance nodulation division family，RND)是引起不动杆菌属多重耐药最重要的外排系统，由膜融合蛋白、RND转运蛋白和外膜蛋白三部分组成。当下由于碳青霉烯类药物大量不合理使用，使细菌固有的主动外排系统表达增强，碳青霉烯类药物被主动外排出菌体外，阻碍药物发挥作用，从而增加了CRAB的发生风险。目前尚未研制出针对RND外排泵的有效药物，探究外排泵的耐药机制，寻找安全有效的外排泵抑制剂可有效缓解CRAB的发生。

RND转运蛋白识别的药物底物广泛，是流行病学常用的检测指标。与鲍曼不动杆菌多重耐药相关的RND外排泵主要有Ade ABC、Ade IJK、Ade FGH、Ade DE、Ade XYZ等类型。其中Ade DE、Ade XYZ比较少见，表达及调控机制等相关报道很少。

3.1 Ade ABC Ade ABC是最早发现的主动外排泵，也是鲍曼不动杆菌产生多种耐药的最重要原因，存在于大多数鲍曼不动杆菌中。Ade ABC结构基因分别由Ade A、Ade B、Ade C三个相连的基因组成，Ade A编码膜融合蛋白、Ade B编码转运蛋白、Ade C编码外膜蛋白构成三聚体，将抗菌药物排出菌体外，从而产生耐药性。一般情况下，Ade ABC表达低下或不表达，当鲍曼不动杆菌多重耐药时，Ade ABC表达明显增强[9]。有研究表明，Ade ABC外排泵过表达时，复合调控基因Ade SR序列未见有突变或插入序列，外排泵的过表达不是调控因子的突变引起的[10]。其他可能的机制如基因环境的改变对调控基因的影响有待进一步的研究。

3.2 Ade IJK Ade IJK是第二个被发现的主动外排泵，与鲍曼不动杆菌多重耐药密切相关，存在于大多数鲍曼不动杆菌中。Ade IJK由Ade I膜融合蛋白、Ade J转运蛋白、Ade K外膜蛋白组成。Ade IJK在过高表达时具有自身毒性特点，因此高表达水平低于Ade ABC。有研究表明，Ade IJK在亚胺培南耐药的鲍曼不动杆菌中阳性率可高达90%，表达量较普通敏感株明显增大[11]。Ade IJK的过度表达还介导了鲍曼不动杆菌对氟喹诺酮药物的耐药性[12]。

3.3 Ade FGH Ade FGH被发现时间是这三种主动外排泵中最晚的，其耐药性的研究较少。存在于鲍曼不动杆菌中。Ade FGH和Ade ABC同源性较低，高表达时没有自身毒性特点，在鲍曼不动杆菌多重耐药中发挥着重要的作用。Ade FGH由结构基因Ade FGH和位于上游的调控基因Ade L组成。Ade FGH形成有效的外排通道需要三个结构基因Ade F、Ade G、Ade H共同表达来完成，主要参与β-内酰胺类和氟喹诺酮类等药物的主动外排[13]。

4 生物膜的形成

生物膜是在细菌表面形成的一种多糖成分，是水平基因转移的极好环境，可导致耐药基因的获得；同时，由于生物膜的形成，导致菌体内部缺乏营养，影响细菌对抗生素的反应，从而使细菌耐药性增加[14]。鲍曼不动杆菌的广泛流行与其黏附力强、容易在各种医疗器械上形成生物膜密切相关。具有生物膜形成能力的CRAB主要通过以下两种机制提高耐药性：(1)生物膜内的高密度细菌能够在一定程度上阻止抗菌药物进入细胞基质；(2)生物膜内缺乏营养空气等条件，从而使细菌生长发育缓慢，对抗生素不敏感[15]。生物膜的形成和碳青霉烯类耐药性相互影响相互作用，使其具有强大的获得性耐药和克隆性传播能力。国外一研究发现，生物膜不仅能够使细菌在气管导管上持续存在，还能导致与呼吸道有关的肺部疾病，因此在提高生物膜检测水平的同时，治疗时选择一些具有清除生物膜作用的抗菌药物，减少生物膜对患者的不良影响[16]。

5 药物作用位点的改变

碳青霉烯类抗生素作用方式是抑制胞壁粘肽合成酶，即青霉素结合蛋白(Penicillin-Binding Proteins，PBPs)，从而阻碍细胞壁粘肽合成，使细菌胞壁缺损，菌体膨胀致使细菌胞浆渗透压改变和细胞溶解而杀灭细菌。药物作用位点发生改变会不同程度上影响细菌的耐药性。喹诺酮是对不动杆菌具有潜在抗菌活性的药物之一，鲍曼不动杆菌的靶位点基因gry A或par C的突变使药物结合位点缺失是对喹诺酮产生耐药的主要机制[17]。当PBPs结构功能发生改变时，青霉素和其他β-内酰胺类抗菌药物与结合蛋白的结合能力减弱，从而使细菌抗药性增强[18]。PBPs通过改变药物作用位点，降低了与碳青霉烯类抗生素的结合能力，鲍曼不动杆菌的抗菌能力增强，导致CRAB的产生。

6 小结

碳青霉烯类抗生素对鲍曼不动杆菌有较好的抗菌活性，是临床治疗鲍曼不动杆菌感染的首选药物。近年来，随着此类药物的大量使用，CRAB频现并呈逐年上升的趋势，现已成为WHO多重耐药菌之首，给临床感染控制方面带来了巨大的挑战[19]。如何合理、及时用药，避免新、特、贵等抗生素的盲目使用是临床治疗CRAB面临的巨大压力。耐药机制的研究为临床新药的研究和临床合理用药提供了必要的理论基础。目前，联合用药是治疗耐药细菌感染的有效方法，使用药物组合可以通过降低药物剂量要求，有效降低药物的毒副作用，防止或延缓耐药性的出现。

临床标本的常规培养是确诊鲍曼不动杆菌的常用方法，耗时长且阳性率低。寻找快速而准确的检测方法提高鲍曼不动杆菌的确诊率，是攻克CRAB关键之一[20]。在充分了解耐药机制的基础上，将质谱技术、实时荧光PCR、胶体金等新的检测方法应用到耐药菌株的快速诊断和治疗监测上，对于指导临床合理用药、缓解CRAB具有重大意义。