外泌体在骨关节炎发病及治疗中的作用研究进展

王若欣 张 勉

骨关节炎(osteoarthritis，OA)又称退行性关节炎，主要表现为关节软骨破坏、软骨面出现垂直裂隙且伴有软骨细胞/滑膜细胞反应性增殖、关节囊中有骨及软骨碎片等，但OA的具体发病机制仍不明确。目前对于OA的早期治疗以非甾体类药物治疗为主，但药物治疗不良反应明显且最终仍无法避免关节软骨的退变。晚期以手术治疗为主，但是手术创伤大且费用高昂[1，2]。近年来，以外泌体为对象的基础及临床应用研究逐渐兴起，越来越多的研究表明，外泌体在OA的发展和治疗中都有着极其特殊的作用，对外泌体的深入研究为明确OA的发病机制以及创新治疗方式提供了新的前景。

一、骨关节炎定义及组织改变

一般而言，软骨承受超负荷后会引起表面部位的变薄与结构破坏，随着时间的推移关节软骨会进一步凹陷破损，脱落的软骨碎片进入关节腔内，引起后续的一系列恶性反应最终形成骨关节炎。正常软骨由软骨细胞和细胞外基质(extracellular matrix，ECM)组成[3]。在发生OA的关节软骨中，软骨细胞损伤和修复失衡引起ECM结构破坏。在溶酶体蛋白酶以及胶原酶的作用下，软骨基质内的蛋白多糖成分急剧减少、胶原纤维变性，同时软骨细胞退化且功能受损失去合成ECM的能力。随着关节软骨的病变，软骨承载和缓冲力量的能力下降，软骨下骨逐渐暴露并承受较大应力和摩擦力，进而出现局部骨折、骨坏死，而关节面和周围的骨质代偿性增生形成骨赘，同时可能会伴随骨囊性病变发生[4]。

二、外泌体的基本结构与功能

外泌体(exosomes，EX)是一种由磷脂双分子层膜包裹的囊泡，直径通常在30～120nm左右，几乎所有细胞都能够分泌[5]。外泌体膜上富含胆固醇和鞘磷脂。此外，膜上还富含具有交换以及融合作用的膜联蛋白、参与外泌体运输的四跨膜蛋白家族(CD63、CD81、CD9等)、热休克蛋白家族以及一些细胞特异性蛋白质。外泌体内则含有众多代谢相关酶类、核糖体蛋白、信号转导因子等蛋白质，以及mRNA和miRNA，这些生物活性物质分别对不同的细胞发挥不同的生理作用。外泌体由宿主细胞释放，作用于各种受体细胞，在免疫应答、肿瘤发展、代谢调节等众多生理、病理过程中均起到重要作用。通过外泌体进行细胞间信息交流无需细胞直接接触，外泌体同靶细胞上的膜受体结合，激活胞内信号转导通路进而改变受体细胞的活动与功能。此外部分外泌体膜能同靶细胞膜融合使外泌体内的生物活性物质直接进入受体细胞内发挥作用[6]。

三、外泌体在骨关节炎进展中的作用

OA的发生、发展受到多种因素的影响，目前外泌体作为热门研究方向，为骨关节炎的发展机制提供了新的研究方向。

1.外泌体对关节软骨的影响：关节内存在促炎性细胞因子、抗炎性细胞因子和双向作用因子，三者的动态平衡维持着关节软骨正常的生理代谢。当此动态平衡失调后，将会引起软骨细胞代谢异常，诱发和促进OA。实验证实，在关节腔中存在外泌体参与的成纤维细胞与软骨细胞之间的正反馈通路，促进炎症的发生[7]。当用白细胞介素(interleukin，IL)-1β处理滑膜成纤维细胞分泌的外泌体刺激OA软骨细胞，能够显著上调基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)-13和结合蛋白序列的解聚蛋白样金属蛋白酶(adisintegrin and metalloprotease with thrombospondinmotifs，ADAMTS)-5的表达，同时减少Ⅱ型胶原的分泌。此外，IL-1β处理后成纤维细胞分泌的外泌体中含有较丰富的IL-6、MMP-3、血管内皮生长因子，这些细胞因子在OA早期发挥重要的促进病变发展作用。

此外，IL-1β刺激成纤维细胞后有340个miRNA被上调、24个被下调，在其产生的外泌体中有11个miRNA被上调、39个被下调，在细胞和外泌体内均被上调的miRNA有5个，这说明外泌体中的miRNA种类是细胞选择性的结果。目前研究最广的miR-4454受肿瘤坏死因子α刺激增多，miR-720在促进细胞迁移中发挥作用[8，9]。成纤维样滑膜细胞分泌的外泌体可影响软骨细胞的增殖、分化、迁移及分泌活动，在促进软骨细胞凋亡的同时减少蛋白聚糖的产生，增加细胞外基质成分的降解。以上研究表明，外泌体可减少正常软骨细胞数目、降解细胞外基质，影响关节软骨的正常形态以及功能。

2.外泌体可作为OA潜在生物学标志物：骨关节炎是渐进性退行性疾病，目前主要检测依靠患者自身感觉、影像学诊断和临床特征性症状，仍缺乏统一的诊断学标准。现有的临床诊断以及影像学检查对于患者早期病症缺乏敏感度，因此能够明确的便于检测的早期生物学改变，对于OA的诊断有重要意义。

细胞产生并释放到体液的外泌体能够反映细胞的生理情况，故其有望作为部分疾病的发生、发展的生物学标志物[10]。在关节退行性病变早期，滑液中的Ⅱ型前胶原C端前肽表达增加，浓度升高，可预测早期的OA发生。而血清Ⅱ型胶原C末端肽和C端前肽浓度的动态联合检测对于OA的早期诊断以及严重程度预判有参考价值[11]。此外，ADAMTs与OA发展有关，早期OA患者中ADAMTs4水平高于中晚期患者，与ADAMTs1、3、5正好相反。滑液中提取的外泌体内高于正常浓度水平的miR-200C以及滑液中的相关促炎性细胞因子都可以作为标志，而根据最新研究显示，滑液中提取出的外泌体内lncRNA PCGEM1可能是OA发展早期和晚期的区分标识[12，13]。虽然外泌体具有作为生物学标志物的潜力，但是到目前为止仅有少数因子有应用价值。此外，软骨组织、滑膜组织以及软骨下骨产生的外泌体之间也会相互影响，再考虑到性别、年龄、种族、发病部位等因素，以及数量庞大的不同因子，还需要进行更多的检测与实验。

四、外泌体在骨关节炎治疗中的作用

1.干细胞外泌体对OA治疗的积极作用：目前很多研究表明间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSCs)来源的外泌体(MSCs-EX)对治疗OA有积极作用[14]。Zhang等[15]研究证实MSCs-EX能够从多个方面缓解OA的发展。间充质干细胞外泌体通过介导动态修复进程加快软骨修复，在大鼠骨软骨缺损处加入MSCs-EX处理后新软骨组织形成显著增多，s-GAG和Ⅱ型胶原蛋白的表达显著提升，同时Ⅰ型胶原蛋白表达下降，软骨深层组织中可观察到有增大间隙的肥大软骨细胞，软骨下骨完全恢复，新生软骨组织同原组织结构整合良好。MSCs-EX增强细胞增殖并减少细胞凋亡，MSCs-EX处理后软骨组织和上覆滑膜组织中PCNA阳性细胞显著增加，同时凋亡软骨细胞数量明显减少。Liu等[16]也研究发现在小鼠OA模型中，MSCs-EX通过ln-cRNA-KLF3-AS1/miR-206/GIT1轴促进OA中软骨细胞的增殖并且抑制其凋亡。MSCs-EX促进M2型巨噬细胞分化且同时减少M1型巨噬细胞和炎性细胞因子分泌。

MSCs-EX主要通过腺苷介导的AKT和ERK信号通路调节软骨细胞的生存、增殖以及基质合成[17]。当外泌体作用于软骨细胞时，AKT和ERK信号通路在1h内开始磷酸化并在6h达到巅峰，说明MSCs-EX能够很快地激活软骨细胞，促进软骨细胞代谢活动快速增加和相关基因表达。此外，软骨细胞通过摄取外泌体还可以对自身活动产生影响。Zhang等[15]研究发现，软骨细胞在遇到MSCs-EX后会快速将其吞入胞内，并且大部分吞入的外泌体会较长时间集中存在于胞质内，同时细胞增殖相关的基因如生存素、Bcl-2、FGF-2等的mRNA水平会在细胞同MSCs-EX直接接触24h后明显上升。同时与细胞迁移、分化、基质合成等活动相关的基因表达在4h后也有显著提高。还有研究发现MSCs-EX可抑制IL-1β、IL-6、TNF-α等促炎性细胞因子的表达，同时促进IL-10等抗炎性细胞因子的表达，因此MSCs-EX也具有一定的抗炎潜能。

2.外泌体miRNA对OA治疗的作用：外泌体中含有大量的miRNA，miRNA通过调节组织中各种细胞的基因表达影响细胞的各项活动。外泌体miRNA除了作为OA早期生物学标志物的潜在价值外，还有治疗的潜在可能。

在MSCs-EX内含有大量的miRNAs，可调节多种重要的细胞信号转导通路，较为主要的有ATK、ERK、SMAD等[18]。miR-125b和miR-320能够通过下调ADAMTs而减轻OA的发展[19]。有关研究表明miR-23b是人间充质干细胞向软骨细胞分化过程中有重要调节作用，miR-221和miR-92a则有可能在促进软骨细胞增殖和分化方面发挥作用[20]。此外，miR-140、miR-30a、miR-558、miR-476b和miR-142-3p也可以在抑制IL-1β和TNF-α这两个促炎性细胞因子的表达，同时抑制它们下游的信号转导通路。

对外泌体进行人工修饰或干预后治疗OA目前也备受关注。Jones研究显示滑膜间充质干细胞具有使软骨再生的组织特异性，对于软骨再生具有重要的潜力。外泌体是Wnt信号通路中的一种潜在的细胞外运输载体，外泌体中的Wnt5a/b通过激活Hippo-YAP信号通路中的YAP(yes-associated protein)，对抗经典的Wnt/β-catenin信号，减少包括转录因子SOX9在内的主链β-catenin的基因表达，由此调控ECM的基因表达和软骨形成[21,22]。Tao等[23]实验发现，滑膜间充质干细胞分泌的外泌体中Wnt5a/b含量较高，会激活YAP引起软骨细胞的增殖和迁移，但是会引起SOX9表达降低以及ECM蛋白合成分减少。而miR-140-5p能够通过增强SOX9以及蛋白聚糖的表达维持软骨内细胞稳态进而缓解OA的进程，利用添加核酸的方法在滑膜间充质干细胞(synovial membrane-derived MSCs，SMMSCs)以及其外泌体中过表达miR-140-5p，能够促进软骨细胞的增殖和迁移的同时促进软骨细胞合成ECM蛋白，滑膜间充质干细胞分泌的高表达miR-140-5p的外泌体具有治疗OA的潜力[24]。因此，外泌体内miRNA为OA的治疗提供了研究方向以及新策略。

3.抑制OA中炎性细胞外泌体对OA的治疗作用：已有实验证明在OA中关节软骨和滑膜细胞产生的外泌体及其内容物起着促进OA发展的作用，如果抑制了相关外泌体的作用就可能缓解OA的进展。目前的研究主要集中在通过相关miRNA抑制物或者类似物(模拟物)抑制炎性细胞外泌体内miRNA及炎性细胞因子作用减缓OA，例如通过向关节腔内注射miR-34a的抑制物，增加Col2a1降低 iNOS，进而缓解OA发展过程[25]。滑膜也是目前研究可能的治疗靶点之一，IL-6作为一种炎性介质在OA中起调控作用，Chen等[26]研究数据显示，通过抑制滑膜组织外泌体中IL-6含量对于治疗滑膜炎以及OA可能有着较好疗效。也有部分研究者在研究干扰特定靶点的新治疗方法，包括抗纤维素抗体、TNF单克隆抗体、抗神经生长因子抗体、抗蛋白酶(ADAMTs和MMPs)和缓激肽抗体等，用以对抗外泌体中相对应的成分，从而发挥治疗作用。此外还可以利用外泌体进行基因治疗，在关节局部导入含有高表达细胞因子基因或者细胞因子抑制剂基因的外泌体，使它们能够缓慢且持续地在OA关节中发挥疗效。

五、展 望

外泌体的发现为研究OA的发病机制、诊断与治疗打开了新的大门。外泌体的内容物会随着OA病程的发展而改变，也有相关实验显示在OA的早、中、晚期会有特定的细胞因子或miRNA等发生特定的上调或下降，故外泌体有可能在未来作为检验OA的生物学标志物。同时外泌体作为软骨组织、滑膜组织、软骨下骨等组织的枢纽，可激活不同的信号通路起传递信息的作用，进而影响OA 的进展。而MSC-EX可通过增加软骨细胞增殖、减少软骨细胞凋亡以及抑制炎症等对损伤关节进行修复，延缓疾病的发展。综上所述，不同细胞来源的外泌体对于OA的发展和诊疗作用已经表现出显著的影响，今后有必要对其进行深入研究。