从丙型肝炎疫苗研发看HCV感染后T细胞介导的免疫反应

刘柯慧 王晖

丙型肝炎病毒(HCV)感染是肝脏疾病发生和死亡的主要原因之一。全球有7 100万慢性丙型肝炎(CHC)患者，每年死于HCV感染相关疾病的人数不少于40万[1]。自HCV发现以来，关于其病毒学、免疫发病机制、治疗等方面的研究都取得了巨大进展。直接作用抗病毒药物(DAA)的研发和临床应用革新了CHC的治疗策略，持续病毒学应答率几乎达到100%[1]。然而，要实现世界卫生组织2030年全球性根除CHC这一目标，仍需要预防性疫苗。本文主要探讨HCV感染后T细胞介导的免疫应答，尤其是影响病毒免疫清除的相关因素、免疫失败的机制等，这些均为成功设计疫苗需要考虑的因素。

人类和黑猩猩急性HCV感染的研究证实，适应性免疫反应与HCV感染后转归密切相关。HCV特异性T细胞的出现与病毒清除和肝脏疾病的发生相关[2]。适应性免疫包括B细胞、CD4+和CD8+T细胞均参与病毒清除。有报道多克隆的特异性CD4+和CD8+T细胞在感染早期已出现，这一现象甚至不因感染的不同转归而有差异[3]。临床上，T细胞免疫失败似乎很少发生，大多数患者均能诱导HCV特异性CD4+T细胞免疫反应。然而，与自发清除病毒的患者相比，CHC患者的T细胞免疫反应在频率和广度上下降更快[3]。因此，除了充分启动外，持续的病毒特异性T细胞免疫反应才是实现病毒清除的关键因素。表型分析显示，病毒特异性CD4+和CD8+T细胞均表达活化标记物和抑制性受体，如程序性细胞死亡-1 (PD-1)，且与转归无关，但表达水平随病毒的清除而下降。此外，HCV特异性CD8+T细胞高表达CD127与病毒清除相关[4]。转录因子T-bet调节效应CD8+T细胞干扰素和细胞毒性因子的产生，并与病毒感染后转归呈正相关[5]。在慢性病毒感染状态，T细胞向记忆T细胞的分化被阻断，病毒特异性CD8+T细胞只保持低频率的激活状态并表达PD-1及其他抑制性受体。另外T细胞的信号转录在急性病毒清除和持续病毒感染这两种状态之间也存在差异。在急性持续性感染早期，病毒特异性CD8+T细胞的代谢、核小体和免疫基因等功能失调，与缺乏CD4+T细胞的辅助有关[6]。耗竭的病毒特异性CD8+T细胞中也显示糖酵解和线粒体功能受损相关的转录因子显著上调[7]。尽管有这些重要发现，但确切的免疫因素及其对病毒清除与持续病毒感染的作用机制仍未完全阐明。

对人和黑猩猩的研究表明[2]，与初次感染相比，再次感染后实现病毒清除的可能性更高，这与记忆性病毒特异性CD4+和CD8+T细胞的快速出现有关。值得注意的是，在缺乏足够CD4+T细胞辅助的情况下，HCV感染的慢性化与病毒特异性CD8+T细胞靶向的MHCⅠ类表位出现病毒逃逸突变有关。另外CD8+T细胞的耗竭可导致病毒血症持续时间的延长[8]。这些结果表明，CD8+T细胞是清除病毒的主要效应细胞，而CD4+T细胞的辅助亦至关重要，它可维持CD8+T细胞的免疫效应，防止病毒在CD8+T细胞靶向的表位内出现逃逸突变。这些结果进一步激发了人们对HCV T细胞疫苗的兴趣，疫苗虽然不能预防再次感染，但能够在再次感染后诱导更强的免疫反应，从而增加病毒清除的可能性。但必须指出的是，即使再次暴露于同源病毒，T细胞介导的免疫保护可能会失败。因此，明确T细胞衰竭的机制是成功研制T细胞为基础的HCV疫苗的前提。

HCV特异性CD8+T细胞的免疫失败主要归因于两种机制：T细胞衰竭和病毒逃逸。T细胞衰竭是在抑制信号背景下抗原慢性刺激的结果，是严重丧失效应功能的状态，其特征为多个抑制性受体高表达、细胞代谢改变、生存受损；并表现为独特的转录程序，包括关键转录因子的改变和潜在、独特的表观遗传性。从CHC患者中分离的HCV特异性CD8+T细胞大多具有这些特征[9]。在LCMV小鼠模型中已首次报道了转录因子TCF-1和TOX的重要生物学作用。TCF-1能够维持病毒特异性CD8+T细胞抵抗病毒感染的慢性化[10]； TOX是免疫细胞衰竭的关键诱导因子，可将持久性抗原刺激转化为特定的转录和表观遗传程序[11]。TOX的表达与PD-1等抑制性受体的表达密切相关。具体地说，TOX过度表达导致衰竭的CD8+T细胞的祖细胞亚群更易存活[11]。因此，从小鼠模型到人类免疫系统的新发现提示，HCV感染是重要的人体免疫学模型。

病毒逃逸突变是HCV应对CD8+T细胞免疫清除的结果，通常发生在感染后的前6个月。逃逸突变可导致蛋白酶功能的改变、肽表位与MHC I类分子的结合位点减少或T细胞受体的识别受损，这些均抑制CD8+T细胞对病毒的识别。长期慢性感染过程中，发生病毒逃逸突变并不常见，反映了该阶段缺乏T细胞介导的选择压力[12]。病毒逃逸将在病毒特异性CD8+T细胞表型上留下印记[9]，也会对丙型肝炎病毒的复制能力产生影响。这种适应性突变有助于特定HLA类型的保护作用，例如HLA-B27、-B57或-A3类型，其与高水平的自发HCV清除相关[13]。显然，不易耐受序列变异的病毒保守区域是T细胞疫苗的最佳靶点。近期研究表明，疫苗可以诱导T细胞对病毒的保守区域产生免疫效应[14]。CD8+T细胞衰竭的两种机制，均与CD4+T细胞的反应直接相关。慢性感染时，CD4+T细胞仅以非常低的频率存在，且增殖能力受损、PD-1和CTLA-4[3]等抑制性受体高表达。因此，缺乏足够的CD4+T细胞的辅助可能是导致CD8+T细胞衰竭的主要因素之一。目前尚不清楚为什么持续感染状态下CD4+T细胞不能维持应答。

DAA治疗后适应性免疫恢复的关键问题是抗原被去除后，HCV特异性CD8+T细胞是否仍然耗尽、能否恢复其效应功能。这一问题不仅对疫苗设计，而且对研究抗原特异性T细胞免疫都非常关键。通过研究DAA治疗患者的HCV特异性CD8+T细胞，发现以TCF-1+CD127+PD-1+表达为特征的记忆样CD8+T细胞的祖细胞在HCV治愈后仍能被检测到，从而实现HCV治愈后特异性CD8+T细胞功能的恢复[15]。但在病毒复发后体内抗原再激活的情况下，TCF1+CD127+PD-1+T细胞群体增多，并伴随着终末衰竭的Eomeshi TCF1-CD127-PD-1hi HCV特异性CD8+T细胞的出现，表明至少在TCF1+CD127+PD-1亚群中存在某种记忆潜能[15]。但这些重新出现的T细胞未能清除病毒，提示DAA治疗后持续存在的HCV特异性CD8+T细胞可能有缺陷，不能简单地通过清除病毒来恢复其功能。另一项研究证实了此观点，在DAA治疗前后CHC患者中，在HCV特异性CD8+T细胞中均可检测到决定CD8+T细胞衰竭的关键转录因子TOX，但在HCV感染自发清除的患者中未检测到[11]。另外，对于HCV特异性CD4+T细胞的研究也获得了相似的结果，这些细胞在DAA治疗后仍保持非常低的频率[16]。

上述研究为我们提供了HCV T细胞疫苗的重要研究基础。预防性T细胞疫苗的概念首先在黑猩猩模型中得到验证。接种表达所有非结构蛋白的重组缺陷型腺病毒疫苗能够保护黑猩猩免于发生急性丙型肝炎[17]。接种疫苗后T细胞的反应出现更早、功能更强、持续频率更高。两种设计用于预防HCV感染的T细胞疫苗也已在人体内进行了免疫原性试验。一种含有HCV核心蛋白和ISCOMATRIX佐剂的疫苗在健康志愿者中仅诱导出较弱的免疫反应[18]。另一种基于复制缺陷的猴腺病毒载体(ChAd3)和编码NS3、NS4、NS5A、NS5B的改良安卡拉痘苗载体的异种增强疫苗，在I期健康志愿者的研究中发现能够持续诱导记忆和效应T细胞群[19]。疫苗诱导的CD4+和CD8+T细胞亚群在其表型和转录谱上与记忆性T细胞相似，这些细胞在自发分离后保持高CD127和低Eomes表达，表明它们在遇到病毒后可迅速扩增[19]。但随后的II期临床研究并未显示出该疫苗对病毒感染具有持续保护作用[20]。这一研究结果至少表明疫苗介导了一些免疫效应，还需要详细的分析来解释这些疫苗接种后T细胞免疫失败的机制。疫苗设计的另一个问题是病毒不同基因型和T细胞表位的复杂性，仅覆盖一个基因型的疫苗很难解决所有问题。

目前仍有许多问题亟待解答，例如：实现CD4+和CD8+T细胞介导的病毒清除的机制是什么？为什么这些细胞在持续感染中不能维持或只能维持在低频率？如何才能最好地诱导保护性免疫？B细胞和中和抗体的作用是什么？对急性和慢性HCV感染的患者以及接受DAA治疗或接种疫苗人群的深入研究，才能更好地破译保护性T细胞免疫的分子、代谢和转录特征，从而提高对不同CD4+和CD8+T细胞亚群及肝炎病毒破坏机体免疫机制的新认知，促进疫苗研发。