Geno-type MTBDRplus分子线性探针杂交技术在结核病诊断与耐药性检测中的应用价值

李 津,李昌锦,杨 洁,黄 婷,樊金燕

（联勤保障部队第900 医院a.结核科;b 检验科,福州350003）

结核菌耐药是结核病治疗过程中面临的主要问题，其疗程长、药物副反应多且严重、患者预后差，已受到越来越多的关注。据统计我国每年新发结核病例中，5.7%为多重耐药结核患者，其中又有8%为泛耐药结核分枝杆菌感染[1]。因而结核菌耐药性检测极为重要。目前临床上多采用BD 960 液体培养法进行结核分枝杆菌的鉴定及耐药性的检测，该方法敏感度低、耗时较长，往往导致诊断及针对性治疗的延误。随着结核菌耐药机制的不断进展，Geno-type MTBDRplus 分子线性探针杂交技术逐步得到重视。这种方法应用生物素标记的引物进行靶序列的扩增，并与固定的寡核苷酸探针杂交，最后通过酶联免疫法显示结果[2]。该技术不仅可对结核分枝杆菌复合群保守序列进行鉴定，还可根据相关基因突变对异烟肼和利福平的耐药表型进行检测。本研究应用线性探针法对结核菌样本进行检测，并与BD 960 液体培养法的检测结果及其药敏结果进行比较，对两种方法的检测效果进行评价，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 研究对象 收集2016年1月～2019年12月在本院门诊及住院的临床确诊结核病患者的送检标本413 例，其中男性315 例（76.27%），女性98 例（23.73%）。年龄8～89 岁。

1.2 仪器与试剂 BACTEC MGIT 960 及相关试剂（美国BD 公司）；GT-Blot 48 及相关试剂（德国Hain Lifescience 公司） ；结核分枝杆菌抗原试剂盒（杭州创新生物公司）；抗酸染色液（珠海贝索公司）。

1.3 检测方法

1.3.1 BD 960 液体培养法检测结核分枝杆菌及异烟肼、利福平耐药性 :严格按仪器使用说明书操作，培养阳性标本经抗酸染色镜检并用结核分枝杆菌抗原检测试剂盒鉴定为结核分枝杆菌。

1.3.2 线性探针杂交法检测结核分枝杆菌及异烟肼、利福平耐药性:严格按仪器使用说明书操作，将PCR 扩增、反向杂交、膜显色技术合为一体，通过引物扩增目的片段，扩增产物与膜上固定的特异性探针杂交，杂交物通过酶显色反应判断结果。

1.4 统计学分析 应用SPSS 17.0 软件进行统计分析，两种检验方式一致性分析采用Kappa 值检验。Kappa 值0.0～0.20 代表极低的一致性，0.21～0.40 代表一般的一致性，0.41～0.60 代表中等的一致性，0.61～0.80 代表高度的一致性，0.81～1 代表几乎完全一致。

2 结果

2.1 两种方法对结核分枝杆菌检出率的比较 413例临床确诊病例的样本，经BD960 液体培养法检测呈阳性为376 例（91.04%），经抗酸染色镜检及凯必利鉴定均为结核分枝杆菌。上述样本经杂交酶显色法检测呈阳性为358 例（86.68%）。两种检测方法的结果相符349 例，符合率为84.5%（349/413），检测结果高度一致。

2.2 两种方法对异烟肼、利福平药敏检测结果的比较 用BD960 液体培养法和杂交酶显色法对108株结核分枝杆菌进行异烟肼、利福平药敏检测。两种检测方法均测定异烟肼敏感有83 例，符合率为76.85%（83/108），Kappa 值=0.731，两者具有高度一致性 ；两种检测方法均测定利福平敏感者有94例，符合率为87.04%（94/108），Kappa 值=0.793，两者结果亦高度一致。

3 讨论

据2020年10月14日，世界卫生组织（WHO）发布了《2020年全球结核病报告》中估算，全球结核病潜伏感染人群接近20 亿，2019年全球新发结核病患者约996 万，发病率为130/10 万，新发的结核病患者中约有3.3%的新患者和18%的复治患者对利福平耐药。估算利福平耐药结核病患者约46.5万，其中耐多药结核病约占78%。因此，结核菌耐药株是我国结核病防治所面临的主要挑战，其治疗疗程长、药物副反应多且难以耐受、患者预后差，寻找一种快速检测且同时检测利福平耐药的技术已受到越来越多的关注。近年来，线性探针法已被WHO推荐用于结核分枝杆菌耐药株的快速检测[3]。

本研究显示，BD960 液体培养法和杂交酶显色法检测结核分枝杆菌的结果高度一致。由于本研究是回顾性观察分析，部分患者未做药敏及耐药检测，所以药敏检测菌株例数较少。在药敏检测结果上与之前相关报道略有不同[4-5]，其原因有待于今后进一步分析。但有研究认为，在细菌量级别为“极低”时，存在无法确定是否对利福平耐药及对利福平耐药检测结果的假阳性例数明显偏高[6]。

由于异烟肼和利福平是治疗结核病的一线药物，其产生耐药是治疗失败的主要原因之一，而传统药敏实验采用罗氏固体培养基或BD 960 液体培养法检测结核分枝杆菌的耐药耗时长（42 天），严重影响临床对患者的及时诊治。与之相比，杂交酶显色法具有操作快速、且直接检测临床标本的优点，不必等待结核菌的培养结果，从而显著缩短了检测周期。另外，杂交酶显色法与GeneXpert 等快速分子诊断技术不同，它不仅检测利福平的耐药情况，而且同时进行异烟肼的耐药性检测，对于临床快速诊断、并检测药物的耐药情况，进行准确评估、制定、实施有针对性的个体治疗提供重要诊断依据。近来研究表明，PCR 线性杂交酶显色法与传统培养法具有较高的一致性，并可明显缩短肺外结核的病原菌耐药性分析的等待时间[7-8]。另外，有研究者指出，初治患者使用分子生物学快速检测技术做出利福平耐药或耐多药结核病的诊断特别注意要进行二次确认，以减少错误的诊断和治疗[9]。本研究因经费原因，所有菌株并未进行测序及耐药突变基因的检测进行确认。

研究表明，PCR 线性杂交酶显色法是一种经济、快捷的结核病实验诊断技术[10]，它与其他检验方法联合应用可进一步提高结核病的诊断效率[11-12]。辅以其他促进排痰的方法，检测阳性率将进一步提高[13]。本研究发现，PCR 线性杂交酶显色法是一种快速、可靠的检测方法，能在24 h 内判断出是否存在结核分枝杆菌感染。因此，我们推测，在经过BD 960 液体培养法培养后，可以不需要42 天的培养，在培养周期中优化选择出一个比较好的时间节点培养出数量级别的杆菌后，再使用PCR 线性杂交酶显色法，可以清楚直观地显示INH 和RIF 的耐药情况，增加结果的准确性。