原发性舍格伦综合征患者血浆弗林蛋白酶和Th1型细胞因子水平表达与唇腺损害及相关腺体功能的关系研究

岳晓琳，米晓燕，白圆圆，周红敏

（邯郸市中心医院免疫科 河北邯郸 056000）

原发性舍格伦综合征（primary Sjogren’s syndrome，pSS）是一种自身免疫性疾病，在全球患病率约为0.05%～4.80%，在我国患病率约为0.77%[1]。该病主要症状为口眼干燥，部分患者伴有关节疼痛、血液系统损害、腮腺肿大等表现，多数病人发病隐匿，症状进展缓慢，部分患者确诊时，内分泌腺已严重受损[2]。研究表明，pSS 发病是多种因素综合作用的结果，如感染因素、免疫紊乱、遗传因素等，但具体作用机制尚不明确[3]。近年来，有学者发现，辅助性T 细胞1（helper T cell 1，Th1）型与pSS 发病有关，Th1 型细胞可产生多种致炎因子，这些因子能促进B 细胞活化，参与pSS 发生与进展[4]。而患者的腺体在炎症作用下，可能引起不可逆性的腺泡损害与腺体功能破坏，影响腺体功能[5]。另有研究认为，弗林蛋白酶（FURIN）对外周免疫耐受性有调节作用，其在Th1 型淋巴细胞中呈过表达[6]。基于上述背景，本研究拟分析pSS 患者血浆FURIN和Th1 及Th2 型细胞因子水平与唇腺损害及相关腺体功能指标的关系，进一步明确pSS 发病机制。

1 材料与方法

1.1 研究对象 纳入邯郸市中心医院2017年8月～2019年8月收治的pSS 患者109 例作为pSS 组，临床表现：口干62 例，眼干46 例，关节疼痛35 例，呼吸困难21 例，咳嗽38 例。其中男性44 例，女性65 例，年龄30～58 岁，平均年龄46.54±8.36 岁；体质量指数19～24kg/m²，平均22.29±1.43kg/m²；抗SSA 抗体：阳性85 例，阴性24 例；抗SSB 抗体：阳性69 例，阴性40 例。选取同期于邯郸市中心医院体检的健康体检者90 例作为对照组。其中男性38 例，女性52 例，年龄32～59 岁，平均年龄47.10±9.03 岁；体质量指数18～24 kg/m²，平均22.65±1.32kg/m²。两组基线资料比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

纳入标准：①pSS 组：满足pSS 的诊断标准[7]；首次入院就诊；在治疗前配合完成相关检查；认知功能、精神状态正常；签署知情同意书。②对照组：身体健康状况较好；性别、年龄、体质量指数与pSS 组匹配；认知功能、精神状态正常；知情同意。

排除标准：患其他自身免疫性疾病者；恶性肿瘤者；因血管性假血友病、白细胞减少症、骨髓增生异常综合症等其他疾病引起的血液系统症状者；糖尿病患者；慢性病毒感染者。研究方案获邯郸市中心医院伦理委员会批准。

1.2 仪器与试剂 主要仪器为酶标分析仪（山东竞道光电科技有限公司，JD-SY96S），主要试剂为人FURIN 酶联免疫吸附（简称酶免）检测试剂，血清白介素（interleukin，IL）-2，IL-7，γ 干扰素（interferon-γ，INF-γ）酶免试剂，均由上海臻科生物科技有限公司提供。

1.3 方法

1.3.1 血浆、血清指标检测：所有受试者在治疗前或体检当日行各指标检测，采集4ml 空腹静脉血，分装于两管。将其中一管血样行抗凝处理，3 000r/min 离心20min，离心半径10cm，分离血浆，存放至-70℃冰箱备用，经酶免法测定血浆FURIN 水平。另一管血样无需行抗凝处理，离心20min，转速、离心半径同上，分离血清，保存方法同上，经酶免法测定血清IL-2，IL-7，INF-γ，IL-4 和IL-13 水平。酶免检测基本方法如下：根据指标选择以血浆或血清为待测样本，常规设置标准品孔、待测样品孔、空白孔，依次加入100μl 标准品溶液、稀释缓冲液，其中空白孔仅加稀释缓冲液，充分混合，封孔，在37℃下反应2h。洗板4 次，取稀释缓冲液1ml 将检测抗体稀释，充分混合，取已稀释抗体100μl 加入各孔，封孔，在37℃下反应1h。洗板4 次，取生物素抗体1ml 加稀释缓冲液9ml，充分混合，取已稀释生物素抗体100μl 加入，封孔，在37℃下反应30min。洗板4 次，取TMB 底物100μl 加入，封孔，在37℃下反应10min，取终止液100μl 加入，在主波长450nm 处检测吸光度值。以INF-γ/IL-4比值表示Th1/Th2 比值。

1.3.2 唇腺损害及相关腺体功能指标检测:经涎棉棒法测定唾液流率，观察15min 的唾液分泌量，并据此明确单位时间内的分泌量。唇腺病理分级[8]：若唇腺组织4mm²范围内的淋巴结细胞数量≥50 个，则提示1 灶，未见淋巴细胞浸润提示0 级；轻度浸润提示1 级；中度浸润，但未达1 灶标准提示2 级；达1灶标准提示3级；＞1灶即4级，分别赋1，2，3，4，5 分，便于比较。Schirmer 试验：在检测前3min 行麻醉，取受检者下眼睑部位，将Schirmer 试纸悬挂在该处，在5min 后测定试纸泪液湿润长度，待检测完毕，立即将试纸放置在无菌试管中，经盐酸缓冲液给予稀释。

1.3.3 疾病严重程度评估：利用欧洲抗风湿联盟舍格伦综合征疾病活动指数（European league against rheumatism sjgren’s syndrome disease activity index，ESSDAI）评估pSS 严重程度。ESSDAI 评价[9]包括12个项目：如皮肤病变、全身症状、关节病变等，每项计0～3 分，总分范围0～36 分。其中总分≤12分为轻度组（n=37），13～24 分为中度组（n=48），≥25 分为重度组（n=24）。

1.4 统计学分析 经SPSS20.0 软件行数据分析，计数资料用百分比（%）表示，行χ2检验。计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组间比较行独立样本t检验，三组间比较行方差分析，经Pearson线性相关分析患者血浆FURIN 和Th1 及Th2 型细胞因子水平、唇腺损害及相关腺体功能指标的相关性。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组血浆FURIN 及血清Th1，Th2 型细胞因子水平比较 见表1。pSS 组血浆FURIN 及血清IL-2，IL-7，INF-γ，IL-4和IL-13水平均高于对照组，而Th1/Th2 低于对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。

表1 两组血浆FURIN 及血清Th1，Th2 型细胞因子水平比较（±s）

表1 两组血浆FURIN 及血清Th1，Th2 型细胞因子水平比较（±s）

指标pSS 组（n=109）对照组（n=90）tP FURIN（pg/ml）7 534.62±198.631 412.54±323.25156.8750.000 IL-2（pg/ml）2.34±0.871.25±0.3212.1250.000 IL-7（pg/ml）38.15±7.7524.42±5.9914.0890.000 INF-γ（pg/ml）2.91±0.872.15±0.428.0540.000 IL-4（pg/ml）3.39±1.122.10±0.849.0280.000 IL-13（pg/ml）43.29±8.5430.13±5.5312.5970.000 Th1/Th20.86±0.251.02±0.373.6240.000

2.2 不同pSS 严重程度患者的血液指标和唇腺损害及相关腺体功能指标比较 见表2。整体比较知：各指标整体差异均有统计学意义（P＜0.05）。各指标水平随pSS 严重程度的变化趋势有显著性意义（P＜0.05）。多重比较并结合主要数据分析：中、重度组血浆FURIN 及血清IL-2，IL-7，INF-γ，IL-4，IL-13 水平、唇腺病理评分高于轻度组（t中vs轻=13.491，7.559，7.783，13.540，19.272，5.339，13.502；t重vs轻=19.600，16.414，8.763，19.734，36.092，11.192，23.032，均P＜0.05），且重度组高于中度组（t=13.707，6.403，4.710，4.240，12.280，6.917，6.457，均P＜0.05），而中、重度组Th1/Th2，唾液流率及左、右眼Schirmer 试纸浸湿长度低于轻度组（t中vs轻=7.548，3.013，14.134，24.229；t重vs轻=8.115，6.803，33.086，42.715，均P＜0.05），且重度组低于中度组（t=3.178，8.000，18.043，18.641，均P＜0.05）。

表2 不同pSS 严重程度患者的血液指标和唇腺损害及相关腺体功能指标比较（±s）

表2 不同pSS 严重程度患者的血液指标和唇腺损害及相关腺体功能指标比较（±s）

注：差异分析的整体比较为单因素方差分析。多重比较为LSD-t 检验，显著性标记a,b 分别为和轻、中度组相比P ＜0.05。趋势检验为两分类转化后的Cochran Armitage 趋势检验。两分类转化界值为对应指标的3 组总均值，统计赋值：≥总均值为1，＜总均值为0。

指标轻度组（n=37）中度组（n=48）重度组（n=24）差异检验趋势检验F P χ2P FURIN（pg/ml）7 417.31±56.377 551.91±35.20a7 680.89±42.19ab218.9040.00065.2580.000 IL-2（pg/ml）1.89±0.262.42±0.36a2.93±0.21ab87.8250.00061.5030.000 IL-7（pg/ml）34.63±2.1337.72±1.53a40.06±2.69ab54.7060.00026.0760.000 INF-γ（pg/ml）2.41±0.113.07±0.28a3.36±0.26ab158.2300.00064.5820.000 IL-4（pg/ml）2.48±0.233.60±0.29a4.37±0.14ab468.8920.00060.4150.000 IL-13（pg/ml）39.84±3.2543.48±3.01a48.23±2.11ab59.9620.00022.9410.000 Th1/Th20.97±0.040.85±0.09a0.76±0.15ab37.6790.0009.1560.000唾液流率（ml/min）0.08±0.020.07±0.01a0.05±0.01ab33.5760.00029.0200.000唇腺病理评分（分）2.76±0.203.61±0.34a4.12±0.26ab187.1930.00065.9840.000 Schirmer 试纸浸湿长度（mm）左眼7.00±0.465.56±0.47a3.78±0.15ab428.8760.00060.8220.000右眼7.22±0.335.41±0.35a3.95±0.22ab786.7390.00067.5960.000

2.3 抗SSA 抗体、抗SSB 抗体与血浆FURIN 及血清Th1，Th2 型细胞因子的关系 见表3。抗SSA抗体、抗SSB 抗体阳性患者的血浆FURIN 水平及血清IL-2，IL-7，INF-γ，IL-4，IL-13 水平高于阴性患者，Th1/Th2 低于阴性患者（P＜0.05）。

表3 抗SSA 抗体、抗SSB 抗体与血浆FURIN 及血清Th1，Th2 型细胞因子的关系

2.4 血浆FURIN 和Th1 及Th2 型细胞因子水平、唇腺损害及相关腺体功能指标的相关性 见表4。经Pearson 线性相关分析提示，血浆FURIN 水平与血清IL-2，IL-7，INF-γ，IL-4，IL-13 水平及唇腺病理评分呈正相关（r=0.362，0.511，0.511，0.640，0.632，0.515，均P<0.05)，与Th1/Th2，唾液流率及左、右眼Schirmer 试纸浸湿长度呈负相关（r=－0.715，－0.404，－0.413，－0.505，均P＜0.05）。

3 讨论

pSS 可导致多个系统受累，女性患者多于男性，这主要与性激素水平有关，性激素失衡在女性群体中较常见，其能对腺泡细胞凋亡进行调节，靶细胞变化可以导致自身侵占的炎症反应加速，引起外分泌腺炎，促进pSS 发生[10]。该病能引起眼部、口腔症状，病程长，治疗难度大，复发率高[11]。临床进一步明确pSS 的发病机制，对改善预后而言至关重要，但该病发病机制复杂，临床尚未完全明确。目前，研究指出，FURIN 在多种疾病进展中存在重要作用，其可能通过对蛋白代谢进行调节，参与自身免疫性疾病进展[12]。pSS 作为自身免疫性疾病的一种类型，其病情进展可能与FURIN 表达有关，但有待临床证实。

FURIN 的作用底物包括血清蛋白酶、神经肽等，具有重要生物功能，在多种疾病评估中有所应用，刘恒等[13]发现宫颈癌患者病灶组织内的FURIN 水平显著上调，其能促进新生血管形成，增加癌细胞增殖风险。汪洋等[14]认为，FURIN 参与了神经精神病的进展，如精神分裂、老年痴呆、癫痫等，其主要通过调节肽类激素、生长因子等发挥作用。本结果显示，pSS 患者的血浆FURIN 水平较健康者明显升高。FURIN 能促进唾液内B 细胞、淋巴细胞浸润过度激活，导致多克隆抗SSA 抗体、抗SSB 抗体产生，其还能对细菌毒素进入细胞进行介导，通过细菌毒素发挥致病作用[15]。有学者[16]发现，FURIN 在其他自身免疫性疾病发生中也有参与，例如重组FURIN 对IL-7，IL-1α 释放有促进作用，导致患者炎症加重，从而加重病情，此外，该研究还发现，炎症因子活化能对FURIN 表达进行诱导，进一步证实其表达与炎症因子密切相关。本研究则发现，pSS 患者的血清IL-2，IL-7，INF-γ，IL-40和IL-13 水平增高，而Th1/Th2 降低，提示炎症因子参与了pSS 的进展过程，患者存在Th1，Th2细胞表达紊乱。IL-2 作为典型促炎因子，可导致IFN-γ 释放增加，唾液流速减缓，对唾液腺内炎症浸润存在促进作用[17]。IL-7 在正常情况下能确保T细胞稳定性，在病理状态下呈过表达，并能促进唾液内IL-7 诱导生成的T 细胞增加，加重淋巴细胞浸润程度[18]。INF-γ 能促进促炎趋化因子分泌，破坏内皮细胞屏障功能，促进唾液内淋巴细胞浸润，降低唾液分泌量[19]。IL-4 可能利用IL-4/STAT6 转导通路，将自身抗体破坏，诱发分泌功能障碍，从而参与pSS 病情进展[20]。IL-13 与IL-4 的作用非常相似，二者均能对B 淋巴细胞表面抗原表达进行诱导，促进其增殖、分化，当T 细胞异常时，能释放IL-3，导致其表达水平增高[21]。各炎症因子水平增高可能进一步诱导FURIN 表达，重组FURIN 可反过来促进炎症因子释放，上述因子可能通过共同作用，引起免疫紊乱，促进pSS 发生与进展。

本研究提示随着pSS 病情越重，患者的血浆FURIN 水平及机体炎症、唇腺损害及相关腺体功能下降也相应加重。这可能是由于患者病情进展后，局部应激反应加重所致，导致释放的炎症因子增多[22]，而炎症因子能介导FURIN 表达，致血浆FURIN 水平增高，泪腺功能损害进一步加重。本次结果显示，抗SSA 抗体、抗SSB 抗体阳性患者的血浆FURIN 水平较阴性者下调，且炎症更严重，而Th1/Th2 下降。抗SSA 抗体、抗SSB 抗体与皮肤疾病的发生密切相关，二者可直接参与皮肤损害。通过之前的分析提示，FURIN 可以通过过度激活淋巴细胞浸润，致抗SSA 抗体、抗SSB 抗体生成增加，这可导致pSS 患病风险及皮肤受损程度加重。此外，炎症反应以及Th1/Th2 下降，表明患者机体存在明显的免疫机制紊乱，可能导致抗SSA 抗体、抗SSB 抗体阳性率增高。通过进一步分析发现，血浆FURIN 水平与血清IL-2，IL-7，INF-γ 水平及唇腺病理评分、唾液流率、Schirmer 试纸浸湿长度均有相关性。本研究通过之前的分析，认为FURIN 过表达可能致唾液内B 细胞、淋巴细胞浸润激活，而在这种病理作用下，可刺激炎症介质释放，致促炎因子上调，炎症加重，唾液分泌减少，眼干症状也加重，且炎症因子表达上调可促进FURIN表达增高，加重机体损害，引起异常。既往研究[23]局限于分析疾病活动评分、炎症因子等常规指标对pSS 的评估价值，而本研究则分析了pSS 患者血浆FURIN表达及其与Th1 及Th2 型细胞因子、唇腺损害及相关腺体功能的关系，更加了解该病的发病机制，临床可考虑将下调血浆FURIN 水平作为其治疗新靶点。综上所述，FURIN 在pSS 患者的血浆中含量增高，血浆FURIN 与患者的Th1 及Th2 型细胞因子、唇腺损害及相关腺体功能指标存在相关性，FURIN有望成为评估pSS 发生与进展的重要指标。本研究局限性在于因受纳、排标准以及研究时限的限制，所收集到的病例样本较少，未来还需增加样本量进行探讨，提高研究数据的准确性。