lncRNA在肝细胞癌索拉非尼耐药中的最新研究进展

纪雷 纪道林，2 鲍冬冬 综述 谭刚 校审

肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是最常见的原发性肿瘤，约占所有肝癌的75%，是癌症相关死亡的第2大常见原因[1]。全球每年约有80万例HCC新发病例，约占癌症总数的5.6%[2]。据统计有超过75%的HCC病例发生在亚洲地区，其中中国占全球所有病例的一半以上[3]。HCC不仅恶性程度高，且浸润和转移能力强，3年生存率为12.7%[4]，5年生存率仅为10%[5]。随着医疗技术和基础研究的发展，人们对疾病的认识不断加深，全球医学界认识到HCC的耐药是影响疗效的瓶颈，是亟待解决的大问题。因此，了解HCC耐药产生的分子机制至关重要。

索拉非尼(Sorafenib)作为一种口服激酶抑制剂，是全球公认的肝癌一线靶向药物[6]。该药的作用机制主要是通过阻断生长因子VEGF、PDGF和c-Kit等多种酪氨酸受体激酶，从而抑制Raf/MEK/ERK等介导的信号转导，显示其抗肿瘤活性。

长链非编码RNA(Long non-coding RNA，lncRNA)是长度超过200个核苷酸的非编码RNA，起初认为是大量转录的副产物，生物学意义较低。后来发现lncRNA能够参与疾病发生发展，且可作为多种肿瘤的抑癌因子和致癌驱动因子，参与调控相关信号通路，进而影响肿瘤进展[7]。有研究表明lncRNA在HCC中对索拉菲尼的耐药起着正向或负向的调控作用。因此，揭示lncRNA在HCC化疗耐药中的调控机制，为寻找新的分子治疗靶点、完善治疗方案以及提高预后发挥重要的作用。

1 lncRNA与HCC

lncRNA作为一类与调控表观遗传、转录和转录后多层面等相关的重要因子，正越来越受到科学家关注。lncRNA异常表达和突变与肿瘤发生、转移和肿瘤分期密切相关[8-9]。此外，lncRNA在某些类型的癌症中特异性表达，并在循环血液或尿液中检测到[10]。例如Panzitt等[11]发现lncRNA HULC在HCC患者的肿瘤和血浆中均上调，是HCC的潜在生物标志物。随着深入研究，如今lncRNA也可以作为一类新型的潜在靶点用于HCC的治疗。

2 lncRNA与索拉非尼耐药性

作为HCC一线靶向治疗药物，索拉非尼单药疗效并不理想，中位生存期约为3～5个月[12]。此外，常伴有多种药物相关的化疗副作用，如皮疹，腹泻，血压升高等，并且极易发生耐药。其中耐药是治疗失败的主要原因，这严重影响了患者的长期生存。lncRNA的异常表达与HCC耐药密切相关[13]，被认为能通过调节多种分子机制在耐药中起着重要作用，如诱导细胞凋亡及自噬、调节细胞死亡信号通路、监测肿瘤干细胞(Cancer stem cells，CSCs)功能、调节启动子甲基化程度等。此外，lncRNA可通过竞争miRNA结合和转录，调控miRNA的活性，间接在耐药中发挥重要作用[14]，这种lncRNA被称为竞争性内源RNA(Competing endogenous RNA，ceRNA)，也称为lncRNA海绵。如今，越来越多与索拉非尼耐药性相关的新型lncRNA被发掘，我们必须更加深入了解调控耐药的机制，才能为最终克服肝癌耐药性开辟更多潜在的途径。

3 HCC索拉菲尼耐药相关的lncRNA

3.1 已具备调控机制的lncRNA

3.1.1 长基因间非蛋白编码RNA 8(Long intergenic non-protein coding RNA 8，H19) lncRNA H19(2.7 kb)是最早发现的lncRNA之一，是母系表达的父系印迹基因，位于人染色体11p15.5区域附近。到目前为止，越来越多的研究显示，H19上调了许多与肿瘤细胞侵袭、迁移相关的基因表达，并可通过多种机制影响肿瘤的进程。如Jv等[15]证实了抑制H19和miR-675的表达进而通过AKT/GSK-3β/Cdc25A信号通路促进肝癌细胞的迁移和侵袭。Ma等[16]发现H19通过调节miR-193a-3p/PSEN1轴促使HCC细胞对化疗药物(多西他赛、紫杉醇、长春瑞滨、5-FU)敏感。此外，有研究显示H19的表达一方面受表观遗传的影响，另一方面也受到其启动子甲基化程度的明显调控[17]。Schultheiss等[18]证实了索拉菲尼耐药性的产生与H19的表达显著下降密切相关，且所有耐药细胞系中均表现出了显著的H19启动子高度甲基化。同时，高表达H19后索拉菲尼治疗敏感性明显增强，调控药物敏感性主要是通过抑制细胞增殖能力，而不是诱导细胞凋亡过程。然而，目前关于H19启动子高甲基化以及能否作为ceRNA对索拉菲尼耐药性影响的研究较少，但恢复H19作用可能成为未来克服HCC治疗中索拉菲尼耐药的潜在靶点。

3.1.2 睾丸相关的高度保守的致癌长链非编码RNA(Testis-associated highly conserved oncogenic long non-coding RNA，THOR)THOR最初是测定人类转录组中超级保守的lncRNA中发现的一种lncRNA，位于人2号染色体[19]。随着研究深入，发现THOR在黑色素瘤、肝癌、肾癌等肿瘤中广泛表达，其高表达与肿瘤的进展密切相关。Cheng等[20]发现THOR可能通过增强PTEN/AKT信号通路，促进肝癌细胞生长和转移。在索拉菲尼耐药的研究中，他们发现肝脏CSCs中显示出THOR的表达显著增加，敲减THOR能降低肝CSCs的自我更新能力，抑制肝脏CSCs扩增，提高肝癌细胞对索拉非尼化疗的敏感性[21]。β-catenin信号通路能够促进肝脏CSCs的激活，参与化疗耐药[22]，且在应用β-catenin抑制剂FH535后，敲除THOR的HCC细胞与对照组细胞相比，消除了肝CSCs比例的差异和自我更新能力的差异[20]，进一步说明β-catenin是THOR调节肝CSCs扩增的关键下游通路。总的来说，THOR可能通过调控β-catenin信号通路，促进肝脏CSCs扩增及索拉菲尼化疗耐药性。

3.1.3 lncRNA ARSR(Activated in RCC with Sunitinib Resistance) lncRNA ARSR是一种新型非编码RNA，位于人9号染色体上，由4个全长591 nt的外显子组成[23]。在耐药的研究中，Li等[24]通过实验证实上调ARSR可调控p10-pi3k/Akt通路促进肝癌对阿霉素的耐药。在HCC索拉菲尼耐药研究中，Yang等[25]发现在肝脏CSCs中显示出ARSR的表达显著增加，下调ARSR表达能够抑制肝脏CSCs的扩增。接下来，他们在索拉菲尼处理的肝癌细胞系中下调ARSR表达，发现耐药细胞对索拉非尼敏感性明显增加，意味低水平的ARSR患者受益于索拉非尼治疗，进一步证实了STAT3是ARSR的下游靶基因。说明lncRNA ARSR通过调控STAT3信号通路，促进肝脏CSCs扩增及索拉菲尼化疗耐药性。

3.1.4 组蛋白甲基化转移酶2(Enhancer of zeste homolog 2，EZH2)相关长链非编码RNA(Highly expressed in hepatocellular carcinoma，HEIH) lncRNA HEIH是一种功能性非编码RNA，位于人染色体5q35.3上。最初是在鉴定乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)相关HCC的lncRNA谱中发现的一种高表达水平的lncRNA，并证明HEIH具有促进肿瘤进展的作用[26]。Ma等[27]证实在肝癌细胞中，敲减HEIH后miR-199a-3p表达量明显上调，同时肿瘤恶性生物学行为受到了明显抑制，说明lncRNA HEIH能够作为ceRNA在肝癌中发挥重要作用。Shen等[28]发现在耐药HCC组织和细胞系中HEIH的表达明显升高，并在小鼠异种移植模型中升高，证实下调HEIH可显著增强索拉非尼介导的肿瘤生长抑制作用。接下来他们通过StarBase在线软件程序，搜索与HEIH互补碱基配对的miRNAs，发现miR-98-5p中包含HEIH结合位点，用双荧光素酶报告和RNA免疫沉淀法证实了HEIH与miR-98-5p的相互作用，HEIH沉默能够促进耐药细胞中miR-98-5p的表达，说明HEIH与miR-98-5p表达呈负相关，敲低HEIH可通过调控miR-98-5p增强耐药细胞对索拉非尼的敏感性。PI3K/AKT通路作为一种重要的细胞内信号通路，其激活与HCC对索拉非尼的获得性耐药有关[29]。因此进一步验证miR-98-5p对索拉非尼耐药的影响是否由PI3K/AKT通路介导，分别单用PI3K抑制剂(WM)、anti-miR-98-5p 以及WM+anti-miR-98-5p处理耐药细胞系，显示WM处理降低了PI3K和AKT水平，此外WM处理还减轻了miR-98-5p抑制(anti-miR-98-5p 处理)诱导的耐药细胞中PI3K和AKT水平的升高，表明miR-98-5p抑制激活了索拉非尼耐药细胞中PI3K/AKT通路。功能实验也发现miR-98-5p抑制可通过激活PI3K/AKT通路促进肝癌细胞索拉非尼耐药，而WM可逆转这个促进作用。说明miR-98-5p抑制可通过调节PI3K/AKT通路的激活，增强了索拉非尼耐药肝癌细胞的索拉非尼耐药。此外，Western blot分析还显示，HEIH缺失降低了索拉菲尼耐药肝癌胞癌中PI3K和AKT的表达，而抑制miR-98-5p后这种降低作用被减弱[28]，说明HEIH可竞争性结合miR-98-5p，调控PI3K/AKT通路，从而增强索拉非尼化疗耐药性。

3.1.5 HCC相关长链非编码RNA(Hepatocellular carcinoma-associated long non-coding RNA，HANR) lncRNA HANR是一种在HCC中特异性表达的非编码RNA，Xiao等[30]发现HANR沉默可调控GSKIP/GSK3信号通路抑制HCC增殖，增强阿霉素的化疗敏感性。Shi等[31-32]首先发现HANR能够通过ceRNA机制，促进HCC进展。在索拉菲尼耐药细胞中，HANR的表达水平明显升高，且HANR高表达后显著增强了细胞对索拉非尼治疗的抗药性，同时自噬相关蛋白比例明显升高，细胞凋亡也明显减少，说明HANR通过诱导自噬增强HCC索拉非尼耐药。接着通过软件分析发现HANR可以与miR-29b形成互补碱基配对，miR-29b作为miR-29家族的一员，其作为肿瘤抑制因子已被充分证明，且有报道称miR-29在调控自噬中发挥关键作用[33]。结合上述结论，研究人员提出假设HANR能够作为miR-29b的ceRNA，调控HCC的自噬和化疗耐药性，并通过实验证实miR-29b是HANR的靶基因，miR-29b通过抑制耐药细胞的自噬而削弱HANR介导的索拉非尼耐药。随后使用双荧光素酶报告证实miR-29b与ATG9A之间能够相互作用，ATG9A可做为miR-29b的下游靶点，促进索拉非尼耐药细胞的自噬。因此分析得出HANR能够竞争性结合miR-29b，调控ATG9A的表达，促进自噬相关的索拉非尼化疗耐药性。

3.1.6 核寄生组装转录本1(Nuclear enriched abundant transcript 1，NEAT1) lncRNA NEAT1位于人染色体11q13.1上，存在两个变体，即NEAT1_1(3.7 kb)和NEAT1_2(23 kb)。有报道称NEAT1参与癌症的化疗耐药性[34-35]。此外，最近的研究表明，NEAT1可能参与ceRNA调控网络[36]。在HCC索拉菲尼耐药性的研究中，Kessler等[37]发现在索拉非尼耐药细胞中NEAT1的表达显著升高。Niu等[38]发现NEAT1在HCC中的表达水平与肿瘤分期、淋巴转移、索拉非尼耐药密切相关，与NEAT1高表达组相比，NEAT1低表达组的患者表现出更长的总生存期。随后通过使用在线软件程序Starbase，发现NEAT1与miR-149-5p形成互补碱基配对，并通过双荧光素酶报告验证了NEAT1与miR-149-5p的结合位点，证实miR-149-5p是NEAT1的直接靶点。AKT1是一种在许多癌细胞中过度活跃的原癌基因，有报告表明，AKT1降低了癌细胞对索拉非尼的敏感性[39]。因此通过实时PCR检测NEAT1、miR-149-5p和AKT1三者在索拉菲尼耐药细胞中的表达水平，分析显示miR-149-5p与NEAT1表达呈负相关，AKT1与NEAT1表达呈正相关[38]。说明NEAT1可通过竞争性结合miR-149-5p，调控AKT1的表达，从而促进HCC对索拉非尼的耐药。我们期望进一步研究NEAT1/miR-149-5p/AKT1通路治疗的理想方案(剂量、频率、给药方法)，将是最终临床应用这一发现的关键步骤。

3.2 未具备调控机制的lncRNA

HNF4A-AS1是肝细胞核因子HNF4A衍生的一种lncRNA，是一种反义lncRNA，位于HNF4A的上游。lncRNA AL109659.2则隶属于SLC5A9的反义，Wu等[40]发现HNF4A-AS1和AL109659.2在索拉菲尼耐药细胞中的表达升高，且都显著增强了肝癌细胞对索拉非尼的耐药。Song等[41]通过大数据分析，鉴定HNF4A-AS1可作为潜在的ceRNA，在HCC中发挥作用，但是否在耐药中发挥作用尚未明确。Guo等[42]证实SNHG16在HCC中表达上调，下调SNHG16表达后能够逆转索拉非尼耐药。目前为止，仍然还有许多lncRNA在HCC及索拉菲尼耐药中的生物学功能未被发掘，有必要进一步探索。

4 小结与展望

越来越多的lncRNA被证实与HCC的进展和化疗耐药密切相关，目前已知lncRNA能够通过诱导细胞凋亡和自噬、调节细胞死亡信号通路、肝CSCs扩增、启动子高甲基化等途径，在HCC化疗耐药性中发挥重要作用。值得注意的是，某些lncRNA能够作为miRNA海绵，在化疗耐药中发挥作用。随着芯片技术和高通量测序技术的发展，大量lncRNA在HCC中被发现，但仅有一小部分lncRNA得到了功能表征，而且一些特异性lncRNA与HCC耐药关系的研究，多数仅报道过一次。毫无疑问，需要进行大量的研究去揭示这些 lncRNA在HCC化疗耐药性中的实际功能，一方面要不断地去发掘新的与HCC及耐药相关的lncRNA，这对于提示HCC耐药的发生有重要意义；另一方面继续研究未被表征的lncRNA如HNF4A-AS1和AL109659.2是通过何种途径来影响HCC耐药。同时，lncRNA/miRNA/circRNA在肝癌耐药中的调控轴值得我们进一步研究，以揭示不同种类的耐药相关lncRNA之间复杂的相互作用。更为重要的是，把基础研究真正的融入临床实践中去，要把评估以lncRNA为靶点的治疗策略在HCC耐药中的可行性、安全性和有效性作为重中之重，进行多次、大量的临床试验以期将这种治疗方案尽早投入临床应用。众所周知，lncRNA在HCC的癌变和发展中的作用是广泛而多样的，在肝癌化疗耐药中也涉及复杂的作用机制，因此，有必要充分了解HCC进展的分子过程和化疗耐药性，以确定合适的lncRNA作为治疗靶点，进而改善HCC预后。