基因测序在精准医疗中的发展与应用概述

常 凯，刘晨霞，许宏宣，王艳艳，江忠勇

随着检验水平、数字化治疗设备和多系统联合治疗等技术的发展，人们对疾病的认知程度越加深入，为了给每位患者提供最合适和理想化的治疗措施，精准医疗的概念应运而生[1]。精准医疗高度依赖于对患者的遗传学和其他分子生物学或影像数据分析，使临床预防、诊断和治疗更具特异性，能提高预后水平，降低药物毒副作用等不良后果发生。在精准医疗的大环境下，基因测序技术经历了多次换代，成为精准医疗时代的中坚力量[2]。

基因组携带了生物个体的全部遗传信息，在临床检验学中，基因测序技术弥补了细胞形态学、生物化学、微生物与免疫学的短板，能够直接对人体或病原微生物进行检测、定量及突变位点分析[3]。

1 基因测序技术的发展

基因测序技术发明于1977 年，经过40 余年的发展和进化，该技术已经具有了里程碑式的飞跃。

1.1 第一代测序技术 1977年，TSIATIS A C[4]提出了双脱氧链末端终止法测序，其原理为将ddNTP（缺乏3’-羟基）插入到新和成的DNA 链中，使之不能与下一位脱氧核苷酸形成磷酸二酯键，迫使DNA合成反应停滞。通过电泳分离不同长度的片段，并检测所测片段的末端碱基，拼接好即为完整DNA序列。在此后近30 年间，随着标记技术与工业水平的提高，同位素标记、荧光标记和毛细管电泳技术逐渐进行加持，测序通量和自动化均得到了大幅提升[5]。由于一代测序具有操作门槛低、读取长度长、准确率高（接近100%）等优点，目前临床中多用于单基因病和突变位点的基因检测，其演变出的毛细管电泳法一直作为基因诊断的标准。然而其缺点也体现在通量小、成本高和检测速度慢等方面。

1.2 第二代测序技术 二代测序（Next-generation Sequencing,NGS）技术是继一代测序后的一次全新换代。大多数NGS基于边合成边测序技术，将每个DNA片段螯合或连接到一个芯片上，随后将被标记的核苷酸加入体系使DNA链延伸，在成像系统捕获后通过计算机推演出核酸序列[6]。目前常见的NGS平台多为基于焦磷酸法的454 平台、基于可逆染料标记法的Illu⁃mina 平台和基于四色荧光标记寡核苷酸法的SOLiD平台[7]。NGS 相比上一代测序其数据量提高了约5 个数量级，具有通量高、准确度高、灵敏度高和自动化程度高等特点，临床检验中常用于突变位点检测、病原微生物菌种检测等方面[8]。

1.3 第三代测序技术 第三代测序又称单分子测序技术，以Pacific Biosciences公司的SMRT（single molec⁃ular real-time,SMRT）测序和Oxford NanoPore Technol⁃ogies 公司的纳米孔测序为代表。其原理为不同荧光标记的dNTP，与模板链互补后荧光基团被DNA 聚合酶剪切，作用时间较长的荧光能够被捕获。而没有与模板配对的碱基停留时间很短，不能被检测[9]。三代测序在测序数据量和准确度上较二代测序并无明显提高，但其拥有超长的读取长度（10 kb-15 kb）和运行时间短等优点，可作为二代测序的有益补充。临床多用于病毒基因组检测分析[10]。

2 基因测序在精准医疗的应用

2.1 病原微生物的检验分析 现今，国内大部分临床微生物实验室采用基于微生物对底物产生的生化反应进行自动化菌种鉴定，而药敏实验分析系统多是将抗生素微量稀释在条孔板中加入菌悬液自动孵育并比色分析。对于病毒等不能或难以体外培养的病原微生物常采用抗原抗体检测等方法[11]。基因测序技术基于对微生物遗传物质的特异性能够对病原微生物的菌种、毒力及耐药性等进行有效鉴定[12]。

2.1.1 病原微生物的诊断 病原微生物感染导致的疾病往往具有起病急、危害大和具有传染性强等特点，这就对临床诊断的准确性和时效性提出了较高的要求。基因测序针对微生物的检测技术应运而生并能有效满足上述需求。对已知参考序列的病原微生物，通过NGS 技术能够快速进行鉴别诊断，并能通过序列差异发现新的变种[13]。在2019 年底爆发的新型冠状病毒确诊与溯源工作中，NGS技术扮演了至关重要的作用。

2.1.2 病原体耐药基因检测 病原体耐药性检测的传统方法基于培养与药敏，其固有缺陷为培养周期长和环境因素干扰。虽有PCR 和基因芯片方法可以选用，但对于未知突变类型或未证实位点仍不能进行检测[14]。随着生物信息学与基因数据库的高速发展，全基因组测序（whole-genome sequencing, WGS）技术能够高效便捷地检测出获得性耐药基因，如乙型肝炎病毒耐药检测、人结核分枝杆菌耐药检测等，均能够为精准诊疗提供有益参考[15]。

2.1.3 病原体毒力检测 病原体毒力评估对于预防和控制疾病的早期风险至关重要。WGS 能够通过数据库对毒力的遗传标记进行检测。在精准诊疗过程中，临床医生可以选择性地参考数据库中的背景资料指导和评估用药情况[16]。

2.2 肿瘤诊治中的作用

2.2.1 基因测序在肿瘤诊疗中的应用 不断积累的基因组变化是肿瘤发生发展的本质。肿瘤的侵袭与转移特性使得通过影像和病理的方法很难确定肿瘤原发灶的来源[17]。应用NGS 技术对肿瘤细胞基因组测序并通过数据库比对关联肿瘤与特定基因，对肿瘤的诊治具有重要价值。由于不同个体对同一种药物的敏感性不同，定向杀伤肿瘤细胞的靶向药物成为个体化治疗的焦点。而通过NGS 检测单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms, SNP）在指导个体靶向药物疗效中作用显著，分子靶向治疗策略也表现出更加细化和精准化。例如表皮生长因子受体（epider⁃mal growth factor receptor,EGFR）突变阳性肺癌患者可从酪氨酸激酶抑制剂的治疗中获益[18]；人类表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor-2,HER2）基因受体阳性患者经干扰性单克隆抗体曲妥珠单抗在早期和晚期（转移性）乳腺癌的治疗中具有疗效等[19]。随着靶药治疗的愈发精细化，肿瘤个体化治疗的“同病异治，异病同治”概念被提出，即针对相同肿瘤的差异化用药和针对不同肿瘤相同突变型的相同靶药治疗，目前已在临床中有所应用。

2.2.2 遗传性肿瘤的筛查 在家族聚集性肿瘤中，环境因素虽有一定作用，但遗传因素仍然是家族肿瘤高发的主要原因。肿瘤发生机制中分为单基因突变和多基因突变，目前明确的单基因遗传引起的肿瘤包括遗传性视网膜母细胞瘤、神经母细胞瘤、Wilm 瘤等；而多基因遗传导致的肿瘤则有鼻咽癌、乳腺癌、结直肠癌等。NGS技术对高风险基因进行检测分析，综合评估后给出患癌风险[20]。由于不是所有的基因突变都有明确的意义，所以此方法仍存在一些质疑。但随着信息生物学与相关疾病数据库的愈加完善，将更为准确地预测肿瘤风险，实现肿瘤的早发现、早预防。

2.3 产前筛查与诊断 单基因遗传病经OMIM 收录的已有8000余种，部分发病率高且危害较大的常见单基因病已进入临床检测目录，例如遗传性耳聋、地中海贫血、杜氏进行性肌营养不良、血友病等。NGS 技术能通过检测孕妇外周血样本中的游离DNA（cellfree fetal DNA，cffDNA）确定胎儿染色体是否存在异常[21]。目前，无创产前检查（noninvasive prenatal test⁃ing,NIPT）已在国内逐渐普及，对于产前筛查高风险、年龄≥35 岁的高龄孕妇以及影像学怀疑胎儿有微缺失微重复综合征的人群建议检测[22]。近年来，NIPT Plus 作为常规NIPT 的升级版，通过PCR-free 建库，将检测疾病种类由3 种扩展到100 多种，其中包含染色体非整倍体、染色体大片段缺失∕重复、染色体微缺失∕微重复等。将染色体异常综合征的筛查覆盖率提高近4倍。

3 展 望

近十年来，基因组学及基因测序技术被广泛应用于临床，并在个体化医疗中优势明显。经过测序技术的三代发展，其成本已大幅降低，但对于病患而言近乎万元的自费检查仍然显得价格高昂。由于检测平台的准入成本高、经验及人才的缺乏，测序大多在参考实验室实行。如果下一代测序技术能在标准化、低成本、短周期的方向有所提高，必将辅佐精准诊疗造福于全民。