ATM单核苷酸多态性与放射性肺损伤的研究现状

张 悦，李 华

放射治疗是肿瘤传统的三大医疗手段之一。随着胸部肿瘤发病率逐年上升，患者人数日益增多，胸部放疗患者也逐年增加。然而，肺是辐射敏感器官，即使使用先进的放疗技术，如三维适形和调强放疗，在多射野照射模式下正常肺组织仍不可避免受到低剂量辐照而损伤，导致放射性肺炎（radiation-induced pneumonitis,RIP）和放射性肺纤维化的发生，肺功能恶化、呼吸功能衰竭甚至死亡[1]。常见的肺癌放疗模式中，三维适形放疗的RIP发生率大概在30%-35%，调强放疗（intensity modulated radiotherapy, IMRT）大概有29%-32%[2]，基于容积调强放疗(volumetric modulated arc therapy,VMAT)大概为24%-29%[3-4]。RIP是一种与放疗相关的亚急性毒副作用，并且有高风险向放射性肺纤维化(ra⁃diation pulmonary fibrosis,RPF)转变[5,6]。

1 放射性肺损伤及其发病机制

目前临床放疗多采用高能X射线，可直接断裂细胞核内双链DNA，引发细胞死亡；同时可刺激细胞胞浆线粒体产生内源性游离活性氧(reactive oxygen spe⁃cies,ROS)，并在数小时内持续增加，导致线粒体功能障碍，受损线粒体的残留物在细胞内产生更多的ROS[7]。肺内正常组织受辐射引发的DNA直接损伤或者ROS 间接介导的肺泡损伤，主要是I 型和II 型肺泡上皮细胞以及内皮细胞受损。这些肺组织细胞受损后分泌促炎因子、趋化因子，损伤相关分子模式（dam⁃age-associated molecular patterns, DAMPs）分子，募集淋巴细胞等免疫细胞到辐射损伤部位进行修复。因此，RIP的发生与放射线所致DNA双链断裂损伤密切相关。ATM(ataxia telangiectasia mutated,ATM)是DNA双链断裂(DNA double-strand breaks, DSBs)修复通路中重要的DNA 修复酶，通过调控ATM 蛋白磷酸化下游靶蛋白参与DNA双链断裂修复通路而发挥作用。

2 ATM蛋白在放射性损伤过程中的作用

研究表明，DNA修复基因的遗传变异可调节患者对放疗的敏感性，个体DNA修复能力的差异使患者对辐射诱导的放射性损伤有不同的反应。人群中存在ATM基因遗传多态性现象。ATM不同单倍型携带者，其ATM蛋白的表达水平不同。ATM蛋白是分子量为350-kDa蛋白激酶，参与DNA双链断裂损伤修复的，存在于胞核中。人类成纤维细胞、人淋巴母细胞和外周血淋巴细胞胞核中含量较多。ATM主要有以下五个自身磷酸化位点：Ser367、Ser1893、Ser1981、Ser2996 和Thr1885，通过磷酸化调控双链DNA修复，特别是同源重组(homologous recombination,HR)修复信号通路。在正常未受照情况下，ATM蛋白以二聚体或者更高级的多聚体形式保持失活状态，其激酶域束缚在Ser1981包绕的一个区域内。受到电离辐射刺激后，MRN(MRE11-RAD50-NBS1) 、RPA(replication protein A)、9-1-1(RAD9-RAD1-HUS1)等感应蛋白复合物首先感受到DNA 双链断裂，染色质结构改变，随后被招募到受损位点附近并激活上游蛋白激酶ATM，诱导ATM二聚体在Ser1981位点发生分子间的自磷酸化和惰性二聚体的分离，活性的ATM单体自由移动并磷酸化NBS1和P53 等相应底物在DSBs 损伤点附近聚集，参与修复；并使DNA损伤的信号蔓延，引起放大效应[8-9]。同时，下游靶蛋白包括肿瘤抑制蛋白p53和BRCA1、检查点激酶CHK1∕CHK2、检查点蛋白RAD17和RAD9以及DNA修复蛋白NBS1被激活[10]，然后数百个底物被磷酸化并在DSBs损伤点聚集，使细胞周期停滞，执行修复功能[11]。根据修复的结果，在最终效应蛋白的作用下，细胞继续增殖，衰老或者凋亡。TaKao等[12]同样发现ATM蛋白对于HR修复是必需的。

3 ATM基因多态性与放射性肺损伤的关联

为了证实放射性肺炎易感基因的存在，许多放射性肺炎关联研究通常会选择与DNA 修复功能相关的基因作为候选基因，由于ATM 蛋白在DSBs 修复通路中“传感器”的作用，而使ATM基因被广泛研究。ATM基因位于人类染色体11q22-23上，包含66个外显子，跨越约150kb 的基因组DNA。前2 个外显子，1a 和1b，在选择性转录子中发挥作用不同，起始密码子位于第4外显子，最后的3.8 kb外显子有大约3.6 kb的3′未翻译序列。转录生成的hnRNA 约12kb，经修饰后形成大小为9.125kb的mRNA。Zhang L等[13]发现中国人群ATM 基因的rs189037 和rs373759 这两个位点的A 等位基因可能与RP 风险增加有关。携带AA 基因型的患者发生放射性肺炎的风险较AG∕GG 基因型患者明显增高。此外，肺癌患者等位基因G突变为A后ATM 的表达水平降低。换言之，携带GG 基因型的患者RNA表达明显高于AA和GA基因型患者。该研究表明位于rs189037 启动子区域的单核苷酸多态性的特异效应机制可能是通过改变转录因子的结合位点来调节基因表达的。在该位点周围有一个AP-2α 结合位点，这是一个广泛参与机体生理和病理过程的转录因子，如细胞粘附、组织分化、肿瘤发生和疾病遗传等。AP-2α 通过特异性结合SNP 位点来抑制人类ATM 的表达，携带CC 基因型的患者与AP-2α 亲和力强，而TT基因型患者与AP-2α亲和力较低，因此AP-2α强烈抑制CC基因型中mRNA的表达，而对TT基因型mRNA表达抑制作用较小[14]。在rs189037位点中A等位基因的DNA特异性与转录因子等蛋白相互作用，影响转录活性，从而影响基因表达。这表明ATM基因低表达可能是遗传因素所致放射性副反应发病机制中的一个关键事件。Yang M 等[15]也发现低水平的ATM 表达会增加RIP 的发生风险。此外，P53 基因对辐照也具有多态性，而且作为ATM蛋白的主要下游效应物，在ATM-P53 信号通路中起作用。并且，P53 Arg72Pro 与rs189037 位点单核苷酸多态性在增加RP风险方面表现出加性基因联合效应。Yan Z等[16]的荟萃分析中也得出相似的结论。进一步说明放射性肺损伤的发生与基因多态性尤其是ATM 基因多态性密切相关。

4 ATM蛋白靶向放疗保护剂的研究

目前对于轻度急性放射性肺损伤可给予肾上腺皮质激素以及对症支持治疗，肺内炎症可自行吸收消散。Robbins 等[17]使用肾素-血管紧张素系统（reninangiotensin system，RAS）药物缓解晚期放射毒性，通过靶向作用于氧化剂、炎症和纤维化途径减弱辐射损伤的作用。然而，广泛纤维化和治疗反应不佳者，仍然可因呼吸衰竭和心力衰竭而死亡。由于临床上早期放射性肺损伤患者表现并不一定典型，因此常常延误最佳治疗时间。迄今为止，阿米福汀是唯一获批用于预防放射性损伤的临床药物，Hofer 等[18]研究表明，在正常组织中，阿米福汀可保护DNA免受电离辐射的损伤，同时干扰肿瘤细胞进行DNA双链修复。因为在正常组织中，阿米福汀被碱性磷酸酶水解脱磷酸，产生具有清除自由基作用的代谢产物WR-1065和减少炎症相关因子的表达[19]。但阿米福汀的给药剂量及治疗后的远期疗效、总生存率等尚不明确，还有待进一步研究。而ATM 蛋白介导的信号通路在修复因放射线所致DNA 损伤中发挥的作用逐渐被人们重视。Zhang Ning 等[20]克隆了编码ATM 的全长cDNA，并通过该cDNA 转染修正了共济失调毛细血管扩张症AT 细胞辐射敏感性表型的多个方面。AT 细胞中ATM cD⁃NA 的过表达提高了辐射暴露后的存活率，降低了辐射诱导的染色体畸变，部分纠正了细胞周期检查点的缺陷和应激激活蛋白激酶的诱导。这一对AT细胞缺陷的修正进一步证明了ATM 蛋白效应子功能的多样性，并提出了可能的基因治疗方法。功能研究表明，ATM具有低组织和免疫细胞特异性，并且患者的ATM蛋白表达量与DNA 修复能力显著相关。肺癌患者的DNA 修复能力低于正常人，表达的ATM 蛋白也低于正常人。因此，通过靶向ATM 磷酸化位点，寻找预测放射性肺损伤的靶点，调节ATM 蛋白的表达，提高肿瘤局控率的同时减少正常组织放射性肺损伤的发生风险，即提高治疗比是目前的研究重点。根据个体放疗不良反应的发生风险，决定治疗模式以及放疗方案，以预防放射性肺损伤的发生，提高放疗患者生存质量及远期生存率。

5 问题与展望

放射性肺损伤是胸部肿瘤患者放疗的常见并发症。随着人类基因组计划的完成，在传统循证医学基础上加上人群遗传多态性信息所形成的精准医疗模式已逐渐在临床治疗中开展。对辐射损伤的易感性不同，放疗患者人群中也存在放射性肺损伤易感人群。如何在放疗计划制定前区分这类易感人群，让患者更好受益于临床治疗，这是临床对未来个体化放疗的迫切需求。ATM基因多态性影响DNA损伤修复信号通路，因此本综述总结了对ATM基因多态性位点与放射性肺炎关联研究的结果。虽然目前纳入研究的样本量较少，统计效力不足以推广到临床，但为今后中国肺癌放疗人群的放射性肺损伤易感性研究奠定了基础。相信在今后，多中心、大样本的放射性肺损伤遗传易感性关联研究可以不断完善，获得大数据以支撑个体化放疗的临床推广与应用。