HPV L1壳蛋白、p16蛋白联合细胞学检测对宫颈SIL的检出能力分析

王青慧，郑小妹，万珍玲，赵晓红，张亚芳

(1.海南省妇女儿童医学中心妇产科，海南 海口 570206；2.海南医学院第一附属医院妇产科，海南 海口 570102)

宫颈鳞状上皮内瘤变(squamous intraepithelial lesion，SIL)分为低级别鳞状上皮内瘤变(low-grade squamous intraepithelial lesion，LSIL)和高级别鳞状上皮内瘤变(high-grade squamous intraepithelial lesion，HSIL)[1]。HSIL被认为是宫颈鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma，SCC)的癌前病变，临床SIL的鉴别及诊断对于改善患者预后具有重要意义[2]。近期多项研究表明细胞周期抑制剂p16的表达与宫颈病变进展有关，p16蛋白表达水平常被用于评估宫颈病变，特别是当组织学诊断为中度非典型增生时，有必要依靠p16蛋白来进行辅助诊断[3]。人乳头瘤病毒L1(human papillomavirus L1，HPV L1)壳蛋白具有免疫保护作用，在没有HPV L1壳蛋白表达的情况下会减弱患者宫颈免疫反应，加快病情进展[4]。液基薄层细胞学检测(liquid-based thin-prep cytology test，TCT)在宫颈病变筛查中应用广泛[5]。但是有关TCT联合L1壳蛋白、p16蛋白检查SIL的研究较少，本研究采用TCT联合HPV L1壳蛋白、p16蛋白检查用于筛查SIL，其准确性和临床意义值得进一步探讨，以期提高临床对宫颈病变的诊断率。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2018年1月至2020年12月在海南省妇女儿童医学中心治疗的宫颈病变患者210例为研究对象，其中慢性宫颈炎患者45例，SIL患者136例(LSIL患者72例，HSIL患者64例)，SCC患者29例。纳入标准：①有明确病理学结果；②在我院行HPV L1、p16及TCT检查；③患者及家属知情同意。对纳入研究者记录其体质量指数(body mass index，BMI)、月经史、生育史、性生活史等基本资料。排除标准：①妊娠；②未注射过HPV疫苗；③患免疫系统疾病或使用免疫抑制剂；④盆腔放化疗治疗史；⑤有宫颈手术史。

1.2 检查方法

1.2.1 p16 蛋白检测

通过免疫组织化学方法(蛋白检测试剂盒)对p16蛋白表达情况进行检测，将细胞质和细胞核被染成棕黄色记为阳性。在40×10视野下，观察5个视野下的病变处细胞。检测标准：(-)者其阳性细胞的比例小于5%；(+)为阳性细胞比例在5%～25%之间；(++)是阳性细胞比例在26%～50%范围；而大于50%的阳性细胞则记为(+++)。

1.2.2 HPV L1壳蛋白检测

采用免疫细胞化学方法(HPV L1蛋白检测试剂盒)来检测HPV L1壳蛋白的表达情况。HPV L1壳蛋白检测的依据是细胞核被染色的个数，若有一个以上细胞核被染成红色则为阳性。

1.2.3 TCT检测

收集宫颈外口及宫颈管内脱落的细胞于标本收集管中，立即使用液基细胞保存液进行漂洗，随后进行细胞制片、固定、染色、检测等，由专业人员进行阅片。诊断分组：未见上皮内病变/恶性细胞组(negative for intraepithelial lesion or malignancy，NILM)、无明确诊断意义的鳞状上皮细胞病变组(atypical squamous cells of unknown significance，ASCUS)、LSIL、不能排除高度鳞状上皮内病变组(ASC of can not exclude high-grade squamous intraepithelial lesion，ASC-H)、HSIL和SCC。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 不同宫颈病变患者基本资料比较

各组患者HR HPV感染率比较差异有统计学意义(P<0.01)，而年龄、BMI、产次组间比较差异均无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 不同宫颈病变患者基本资料比较Table 1 Comparison of basic data of patients with different cervical

2.2 不同宫颈病变患者HPV L1壳蛋白阳性表达率比较

不同宫颈病变患者HPV L1壳蛋白阳性表达率比较差异有统计学意义(P<0.01)，进一步每两组间比较结果显示，HSIL患者HPV L1壳蛋白阳性表达率显著低于慢性宫颈炎和LSIL患者(χ2值分别为19.207、35.743，P<0.01)，SCC患者HPV L1壳蛋白阳性表达率显著低于慢性宫颈炎、LSIL患者和HSIL患者(χ2值分别为34.380、50.625、9.426，P<0.01)，见表2。

表2 不同宫颈病变患者HPV L1 壳蛋白阳性表达率比较 [n(%)]Table 2 Comparison of positive HPV L1 capsid protein expression rates in patients with different cervical lesions[n(%)]

2.3 不同宫颈病变患者p16蛋白阳性表达率比较

不同宫颈病变患者p16蛋白阳性表达率比较差异有统计学意义(P<0.01)，进一步每两组间比较结果显示LSIL患者p16蛋白阳性表达率显著高于慢性宫颈炎患者(χ2=21.914，P<0.01)，HSIL患者p16蛋白阳性表达率显著高于慢性宫颈炎、LSIL患者(χ2值分别为53.889、12.106，P<0.01)，SCC患者p16蛋白阳性表达率显著高于慢性宫颈炎、LSIL患者、HSIL患者(χ2值分别为53.139、18.016、5.077，P<0.05)，提示随着宫颈病变进展，p16蛋白阳性表达率逐渐升高，见表3。

表3 不同宫颈病变患者p16蛋白阳性表达率比较[n(%)]Table 3 Comparison of positive p16 protein expression rates in patients with different cervical lesions[n(%)]

2.4 TCT与TCT联合HPV L1、p16对HSIL及以上病变的诊断价值

TCT联合HPV L1、p16诊断HSIL及以上病变的灵敏度和阳性预测值显著高于单独TCT检查(P<0.05)，而特异度和阴性预测值显著低于单独TCT检查(P<0.05)，见表4。

表4 TCT与TCT联合HPV L1、p16对HSIL及以上病变的诊断价值[%(n/N)]Table 4 Diagnostic value of TCT and TCT combined with HPV L1 and p16 for HSIL and above lesions[%(n/N)]

2.5 不同HPV L1、p16表达患者疾病进展情况比较

所有患者随访12个月后复诊，各组患者疾病进展情况率比较差异有统计学意义(P<0.01)，进一步每两组间比较，结果显示HPV L1(-)p16(+)表达患者疾病进展发生率显著高于其他组患者(χ2值分别为21.306、10.857、8.284，P<0.01)，其余每两组间比较差异无统计学意义(χ2值1.385～2.775，P>0.05)，见表5。

表5 不同HPV L1、p16表达患者疾病进展情况比较Table 5 Comparison of disease progression in patients with different HPV L1 and p16 expressions

3 讨论

3.1 宫颈鳞状上皮内瘤变筛查技术

宫颈癌是严重危害妇女生命健康的癌症，但也是可实现“早发现、早干预、早治疗”的癌症。高危型HPV持续感染可导致宫颈癌前病变及浸润癌，大多数女性一生中都会感染HPV，但90%感染者可在2年内被机体清除，只有少部分女性发展为癌前病变或宫颈癌[6-7]，从感染HPV开始至发展为宫颈癌一般会历时10～20年。SIL属于宫颈癌前病变，其病程较长，与宫颈浸润癌的发生发展密切相关，虽然部分SIL是自限性疾病，但HSIL发展成宫颈癌的几率较大，因此，对宫颈SIL的筛查和分流非常重要。TCT、HPV是筛查宫颈病变的常用方法，细胞学筛查虽然具有较高的特异度，但敏感度较低，而且在一些卫生资源匮乏、细胞学病理医师稀缺的农村偏远地区则难以开展高质量的细胞学检查。HR-HPV检测灵敏度虽高，但特异度低，不仅给患者造成一定的思想负担，且增加了不必要的阴道镜检查。随着宫颈病变筛查技术的不断发展，近年来出现的HPV E6/E7 mRNA、p16INK4a和DNA甲基化等检测技术的应用是宫颈病变的筛查技术在细胞学、分子生物学和生物标志物检测方面的不断完善[8-10]。

3.2 HPV L1壳蛋白、p16蛋白联合细胞学检测对宫颈SIL的检出能力

癌症的发生是肿瘤微环境失调、癌基因激活和抑癌基因失活等多因素相互作用的结果。p16是一种肿瘤抑制基因，可阻止肿瘤细胞从G1期发展至S期而抑制细胞增殖，其表达与SIL病变程度有关。HPV L1壳蛋白作为HR HPV的结构蛋白之一，同时是诱导宿主免疫能力的重要抗原，亦是HPV疫苗形成的重要前提。在HPV L1壳蛋白表达缺失的情况下，会使得患者宫颈部分免疫反应逐渐降低，进而引起疾病进一步发展。本研究结果显示不同宫颈病变患者HPV L1壳蛋白阳性表达率的差异有统计学意义(P<0.01)，进一步每两组间比较结果显示，HSIL患者HPV L1壳蛋白阳性表达率显著低于慢性宫颈炎、LSIL患者(P<0.01)，SCC患者HPV L1壳蛋白阳性表达率显著低于慢性宫颈炎、LSIL患者和HSIL患者(P<0.01)。不同宫颈病变患者p16蛋白阳性表达率比较差异有统计学意义(P<0.01)，进一步每两组间比较结果显示，LSIL患者p16蛋白阳性表达率显著高于慢性宫颈炎患者(P<0.01)，HSIL患者p16蛋白阳性表达率显著高于慢性宫颈炎、LSIL患者(P<0.01)，SCC患者p16蛋白阳性表达率显著高于慢性宫颈炎、LSIL患者和HSIL患者(P<0.05)，提示随着宫颈病变进展，p16蛋白阳性表达率逐渐升高。文献报道p16在宫颈癌中呈阳性表达，而其在宫颈良性病变中呈低表达，有学者认为p16可能是宫颈低级别病变到高级别病变转化的标志物[11]。随着SIL病变程度的逐渐加重，HPV L1壳蛋白表达阳性率显著降低，在SCC患者中无表达，考虑为HPV到达宿主细胞DNA后，L1基因启动子发挥分离作用，HPV L1壳蛋白大量缺失，使大量感染细胞产生，促进细胞恶变。对HPV L1壳蛋白进行检测为预测SIL的预后及转归提供了有力依据[12]。项媛媛等[13]研究发现p16蛋白、HPV L1壳蛋白表达阳性可作为宫颈癌前病变出现的分子事件，其在筛查CIN和早期宫颈癌中的价值较高，宋方彬等[8]发现p16染色作为子宫颈癌初筛方案检出子宫颈病变的敏感度与HR-HPV检测相当，特异度与TCT检查相当，且在HR-HPV阳性患者的二次分流中具有优势，以上文献报道与本研究结果相似。

本研究还进一步分析了HPV L1壳蛋白、p16蛋白联合细胞学检测对宫颈SIL的检出能力，结果显示TCT联合HPV L1、p16诊断HSIL及以上病变的灵敏度和阳性预测值显著高于单独TCT检查(P<0.05)，而特异度和阴性预测值显著低于单独TCT检查(P<0.05)。所有患者随访12个月后复诊，各组患者疾病进展情况率比较差异有统计学意义(P<0.01)，进一步每两组间比较，结果显示HPV L1(-)p16(+)表达患者疾病进展发生率显著高于其他组患者(P<0.01)。分析原因为HPV L1壳蛋白(+)p16蛋白(-)的患者，病毒虽然处于复制状态但未整合进入宿主基因组，机体仍具有相应的免疫反应，且pRB通路正常运行，能激活机体免疫保护机制，使体内病毒得以清除。而HPV L1(-)p16(+)表达的患者HPV病毒几乎已经是整合状态，抑制pRB通路发挥作用，免疫反应受阻，高级别CIN中此组HPV转阴率最低，必须提高警惕，并进一步诊断以明确病情，防止漏诊。

综上所述，本研究对相关蛋白及细胞学进行了检测，HPV L1、p16蛋白检测克服了TCT敏感性差的缺点，最重要的是在一定程度上避免TCT细胞学诊断上的主观性。然而，本研究仍存在缺陷，由于时间及样本量不足，需要进一步扩大样本量以继续做深层次的研究。