天山花楸叶黄酮提取物抗心肌缺血再灌注损伤作用机理分析

林伟，熊尚全

福建中医药大学附属人民医院心血管内科，福建福州 350000

抗心肌缺血再灌注损伤（MIRI）为临床常见现象，对机体危害性强，极易导致病死[1]。MIRI 是加重心肌梗死的重要原因。为预防病死，应进行促进心肌血氧供恢复治疗[2]。血供恢复中极易造成再灌注损伤，加重细胞损伤，或致不可逆损伤，在此过程中心肌代谢、心功能和电生理功能等都可能加重受损，出现心肌梗死范围扩大、心律失常或心肌组织缺血性坏死[3]。天山花楸叶是新疆地区出产的天然药材，常用于咳、喘、痰瘀等治疗。现代研究显示，该药可舒张心肌血管，改善心肌缺血[4]。相关研究证明黄酮类成分可治疗心肌缺血和抗氧化，但对天山花楸叶中所含有的黄酮提取物在MIRI 治疗中的作用机制研究较少[5]。该文选取2020 年1 月—2021 年1 月大鼠试验样本50 只，以网络药理学为主要方法，筛选药物化合成分，定位抗MIRI 的有效成分和作用靶点，评价其药效学作用。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

①试剂：选用自制91%质量分数的天山花楸总黄酮。盐酸、氯化镁、氯化钙、氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钾、碳酸氢钙等选用国产试剂。mPTP 孔抑制剂选用CDZ，用于阳性对照。SOD、T-AOC 线粒体制备试剂盒。

②样本：选用SD 大鼠（雄性）作为试验体样本，符合动物实验要求。提前1 周领取样本适应环境，分笼饲养，自由饮食。

③设备：使用离心心脏灌注设备、天平、多功能酶标仪、超声波清洗器以及超低温冰箱、离心机、切片机、匀浆机等标准操作仪器设备。

1.2 方法

1.2.1 试剂调配 配制K-H 灌流液、肝素钠溶液、总黄酮溶液、CDZ 溶液和水合氯醛溶液。

1.2.2 明确药物靶标 根据ADME/T 标准筛选有效化合物以及核心靶标，定位药物靶标，构建相关互动网络与大鼠心肌缺血再灌注损伤模型。

1.2.3 用药方法 ①对照组（n=10）：使用K-H 灌注液给药，在恒压状态下进行110 min 灌注。②模型组（n=10）：K-H 液20 min 灌注，予以20 min 全心停灌，然后予KH 液60 min 复灌。③高剂量FST 组（n=10）：予K-H 液20 min 灌注，再灌注10 min 总黄酮，剂量为1.5 mg/L，然后停灌20 min，K-H 液复灌60 min。④低剂量FST 组（n=10）：予K-H 液20 min 灌注后，使用0.5 mg/L 金丝桃苷实施10 min 灌注，停灌20 min，K-H 液复灌60 min。⑤CDZ 组（抑制剂组）（n=10）：予K-H 液20 min 灌注，1 μmol/L 含抑制剂 灌注液灌注20 min，停灌20 min，K-H 液复灌60 min。

1.3 观察指标

检测血流动力学情况、梗死面积，进行病理检查，分析FST 预处理和氧化应激、mPTP 孔开放相关性。

1.4 统计方法

采用SPSS 24.0 统计学软件分析数据，计量资料用（）表示，比较采用t 检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 筛选化合物

天山花楸叶可提取化合物62 个，从中筛选获得34个候选化合物。候选化合物中，金丝桃苷和芦丁口服用药时难以被有效利用，然而含量丰富，药理学活性较广，其余成分类药性较好，口服用药生物利用率较高。在上述成分中，靶点数目较高度分子包括黄酮类、有机酸类和挥发油类3 种。上述分子可针对多靶点起效，药理活性多样化。小鼠实验证明，该药粗提物可活化超氧化物歧化酶，抑制丙二醛与乳酸脱氢酶，缓解ISO 引起的急性缺血损伤。相关试验显示，天山花楸醋酸乙醇提取物可抗MIRI，其挥发油成分可对至少9 种病菌产生抑制作用。

2.2 化合物与靶标和疾病关系分析

利用数据库筛选34 个候选化合物的靶标，通过对839 个靶标去重处理，总计265 个靶标。靶标度值降序排序，筛除度值＜4 的靶标，其中与候选化合物相关性密切的靶标为78 个。利用数据库筛选靶标相关疾病，总计31 类443 种，32 种与心血管疾病相关，29 个靶标（占比37%）关于心血管疾病。经分析，TSPO 是心肌缺血关键靶点，黄酮类化合物是核心化合物。

2.3 靶标蛋白分析

针对34 个相关化合物构建靶标蛋白互作网络予以分析，可确定TSPO 为关键靶点，该靶点和黄酮类化合物具有紧密联系。TSPO 属于苯二氮卓类受体，在心血管病程中和氧化应激反应中具有影响作用。相关文献显示，TSPO 可通过调节呼吸链、线粒体膜电位调控线粒体功能，对ATP 水解、合成产生影响，ROS 形成与促凋亡蛋白也受其影响。

mPTP 孔开放抑制可通过TSPO 抑制实现，心肌血氧供应阻断或再灌注导致能量代谢异常，减弱ATP 依赖型质子泵作用，造成线粒体跨膜电位减弱和失衡。多因素影响下，mPTP 开放性增强，提升线粒体膜通透性，消除或减弱线粒体跨膜电位，继而增强mPTP 开放性，形成不良循环。为抑制mPTP 开放，可抑制TSPO，抑制氧化过激，调节线粒体膜电位和细胞钙离子，预防钙超载，促进线粒体ATP 稳定供应，降低ROS 活性，对再灌注损伤予以防控。

2.4 血流动力学分析

针对大鼠MIRI 进行建模，可知再灌注后，样本心肌细胞舒缩水平在模型组中降低，高剂量FST 组和低剂量FST 组输送功能增强，CDZ 组有一致性表现，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 各组血流动力学指标比较（）

表1 各组血流动力学指标比较（）

注：较之对照组，*P＜0.05，**P＜0.01；较之模型组，*P＜0.05，**P＜0.01，1mmHg=1.333 Pa

2.5 TTC 染色心肌梗死影响分析

对照组心肌梗死面积占比为（2.21±0.13）%，模型组占比为（72.03±6.82）%，模型组占比较高，差异有统计学意义（F=41.579，P=0.011）。高剂量FST 组占比（46.19±4.58）%，低剂量FST 组为（62.71±5.29）%，抑制剂组为（50.24±4.80）%，上述各组与模型组比较，差异有统计学意义（F=47.62，P=0.013）。提示上述用药方式皆可促进心肌组织保护，缓解心肌梗死。在众组中，高剂量用药效果较先显著，差异有统计学意义（F=51.403，P=0.017）。见表2。

表2 各组心肌梗死面积比较[（）,%]

表2 各组心肌梗死面积比较[（）,%]

2.6 HE 染色分析

对样本进行HE 染色处理，借助显微镜分析心肌组织病理切片。样本观察显示：

①对照组未见细胞形态显著异常，心肌细胞处于有序排列状态，结构相对完整，可见清晰肌纤维横纹，未见炎症性肿胀、坏死发生，未发生肥大或萎缩，具有较完整的长椭圆核形态。观察细胞外膜、间质和相关血管，皆为正常状态。

②观察模型组样本时，可见心肌发生明显病理变化，细胞排列紊乱且稀疏。心肌细胞出现肿胀状态，肌纤维间隙扩大，肌纤维横纹发生断裂迹象或消失。部分心肌细胞发生局灶性坏死或崩解，可见心肌细胞间质出现充血，发生炎性细胞浸润。

③观察高剂量组可见心肌病理变化缓解，肌纤维排列稍显稀疏但较整齐，可见轻度肿胀，未见局灶性水肿或脂肪变性，心肌纤维未见断裂表现，炎性细胞影响范围缩小。

④在低剂量组中，对比模型组，心肌病理变化较弱，纤维排列稍见稀疏和紊乱，水肿程度较轻。炎症细胞浸润、纤维横纹断裂、消失的情况较轻。

⑤在抑制剂组中，心肌病理变化缓解，细胞整齐排列，肌纤维较稀疏，可见轻度细胞肿胀，未见局灶性细胞脂肪变性，少见炎症细胞浸润，未发生肌纤维断裂情况。

2.7 心肌氧化应激反应与FST 相关性分析

FST 可提升心肌组织抗氧化水平，抑制再灌注损伤。较对照组，模型组SOD、CAT 等活性减弱，差异有统计学意义（F=46.221、44.159，P=0.020、0.024），MDA 活性增强，差异有统计学意义（F=40.735，P=0.021）。较模型组，其余各组CAT、SOD 活性增强，MDA 活性较弱，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 各组心肌氧化应激指标比较[（）,U/mg]

表3 各组心肌氧化应激指标比较[（）,U/mg]

2.8 大鼠mPTP 孔开放和黄酮提取物的相关性分析

mPTP 孔开放条件是CaCl2达到200 μmol/L，在此条件下，线粒体A520 指标下降。较之模型组，各组可有效抑制mPTP 开放，缓解线粒体肿胀。

3 讨论

3.1 中草药对心血管疾病的适用性

在现代，心血管疾病是威胁生命安全的高发病。相关研究显示，心血管疾病病死率在现代疾病中占比最高[6]。导致心血管疾病发生的原因较多，遗传因素、饮食，以及肥胖等，均为关键因素。一旦疾病发生，患者极容易死亡。在因病死亡人群中，超过40%是因心血管病死亡[7]。为降低病死率，有效防控心血管疾病具有必要性。生活习惯、饮食结构不良是心血管疾病的常见消极因素，通过促进健康作息与饮食可促进预防，在其治疗中，需要积极探索不良反应低、药效显著的药物[8]。中草药属于天然药物，此类药物自然生成，不同药材成分和药效各异，为疾病治疗提供助力。通过中草药研究，研究者们从药物提取物中发现更多可用于心血管病症治疗的有效成分[9]。

3.2 缺血性心脏病的临床特点

缺血性心脏病是现代常见高病死率疾病，对生存质量和存活期有显著消极影响。在临床治疗中，可采用介入疗法、用药治疗或采用超声疗法，也可进行基因治疗。药物治疗风险较低，适用范围广，为常用手段。为此，医学研究致力于发掘对症药物，促进有效治疗[10]。

心肌血氧供应中断或不足对心肌细胞器、心肌酶结构、细胞结构变化有不良影响，损伤心肌功能，分析其内在原因，是因缺血诱发细胞钙超载，导致自由基含量提升，影响线粒体能量无法常规合成[11]。因血氧缺失影响出现线粒体损伤，此种损伤蔓延，对细胞宏观功能造成破坏。在抑制和修复缺血性损伤时，治疗要点是促进血供恢复[12]。有研究人员对狗进行心肌缺血损伤治疗试验，在试验中，结扎狗冠状动脉，使其持续缺血，然后解除结扎恢复血供，血流灌注恢复较突然，该过程引起室颤，造成狗死亡[13]。

3.3 MIRI 治疗理念与黄酮类化合物应用

医学研究进展后，有研究者提出MIRI 概念，医学研究认为，心肌缺血后血供恢复过程极易发生重症损伤，导致心肌细胞发生结构和功能等变化，影响常规代谢，此种损伤较之缺血损伤更严重，或见不可逆损伤[14]。医学研究显示，黄酮类化合物可改善心脑组织缺血问题，对组织氧化和衰老具有抑制作用，还可抑制肿瘤和炎性反应，对氧自由基具有清除作用，还可提升免疫力。相关文献显示，在MIRI 预防中黄酮类化合物可发挥有效作用[15]。

3.4 该次研究发现

该次研究中，以天山花楸叶为研究对象，提取其化合物，应用软件建模，分析化合物与靶标和疾病之间的相关性，经过研究可知靶标中和心血管疾病联系密切的成分总计29 个，29 个靶标中TSPO 为核心靶标，直接影响心肌缺血，黄酮类化合物是核心化学物分子。针对心血管疾病和相关靶标蛋白创建互作网络进行验证，显示TSPO 为核心靶点。该靶点可对线粒体功能进行调节，对线粒体电位造成影响，并可影响能量代谢过程。为对线粒体膜mPTP 孔进行开放干预，可抑制TSPO，促进mPTP 孔闭合，通过此干预稳定线粒体膜电位，避免发生钙超载，减少氧自由基产生，缓解再灌注损伤，调节能量代谢状态。

该研究经提取物用药后分析显示，心肌梗死情况在高剂量组中得到有效抑制，心肌梗死面积控制在46.19%左右。同类研究中，使用高剂量后也可见一致性表现，在该研究中，高剂量用药后心肌梗死面积为46.22%左右[16]。

3.5 用药方案深度分析

通过模型构建，监测再灌注全周期中血流动力学变化[16]，对比模型组，显示从天山花楸叶中提取的黄酮化合物可显著增强心肌收缩力和心功能，降低再灌注损伤。分析TTC 染色结果，高剂量预处理可缓解再灌注诱发的心肌梗死，缩小损伤面积。

切片观察心肌组织显示，高剂量预处理可修复再灌注后心肌细胞肿胀，缓解炎性细胞浸润问题，抑制心肌纤维断裂。经过心肌组织病理分析可直观了解心肌组织在再灌注中发生的损伤。再灌注发生时，线粒体无法常规进行氧化磷酸化过程，中性粒细胞发生大规模聚集，加之黄嘌呤在水解过程中过度生成活性氧自由基，导致膜脂过氧化作用加重，通透性增强，酶与蛋白质受损，结构功能由此发生变化，核酸、染色体受到攻击，加速细胞凋亡[17]。

为分析氧自由基造成的心肌组织损伤，对MDA 指标、SOD 指标以及CAT 指标进行检测。通过T-AOC 分析可评价心肌组织宏观抗氧化水平。当钙离子超载时，线粒体膜中mPTP 受此影响开放，粒子中＜1 500 质量的部分大量透过mPTP 在线粒体基质中发生作用并提升线粒体渗透压，诱发线粒体水肿，此种肿胀导致细胞能量代谢异常加重，心肌组织因此受损。较之模型组，CDZ 组、FST 预处理用药等可抑制mPTP 孔开放，缓解钙超载以及细胞肿胀导致的细胞损伤，对心肌细胞产生保护作用[18]。

综上所述，天山花楸叶中提取的黄酮化合物可调节心肌舒缩水平，缩小心肌梗死面积，缓解心肌细胞肿胀，抑制氧化应激损伤。对TSPO 靶标蛋白对症施加影响后，线粒体mPTP 孔开放得到有效抑制，线粒体肿胀显著缓解，能量代谢优化，防控再灌注损伤。