水溶性β-葡聚糖对霞多丽干白葡萄酒香气的影响

李洁春，宋欣芫，杨学山，韩舜愈，祝霞*

1(甘肃农业大学 食品科学与工程学院，甘肃 兰州， 730070) 2(甘肃省葡萄与葡萄酒工程学重点实验室，甘肃 兰州， 730070)

葡萄酒酒精发酵过程中，酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)将糖转化为酒精和CO2的同时，还可产生醇、酯、酮、醛、酸等多种挥发性次级代谢产物，构成了葡萄酒的主要香气成分[1-2]。酵母多糖作为良好的发酵助剂，可以明显提升酒体香气品质，改善口感，并具有使用便捷、可控、通用性较强等特点[3]。甘露聚糖作为酵母细胞壁的主要成分，其蛋白端通过与酒体中香气物质作用，可以增加香气的稳定性，提高葡萄酒香气持久性[4]。JUEGA等[5]将甘露聚糖添加到经3株酿酒酵母(W1、W2、W3)发酵的阿尔巴利诺葡萄酒中，发现不同酒样中的挥发性香气成分存在一定差异，其中W1葡萄酒中挥发性物质含量最高，尤其是萜烯类物质香叶醇和芳樟醇等含量明显增加。尹宁宁等[6]研究指出，外源性添加300 mg/L的甘露聚糖，可使蛇龙珠干红葡萄酒样中酯类和萜稀类物质含量分别提高25.2%、50%，酸类物质含量降低7.5%。甘露聚糖(150 mg/L)也可以通过与葡萄酒中的部分香气物质结合降低其挥发性[7]。RIBERIRO等[8]、门颖[9]在干白葡萄酒中添加200 mg/L的甘露聚糖，可以提高其感官评分。酵母多糖除甘露聚糖(35%)外，还包括不溶性的β-葡聚糖(50%～60%)，可被广泛应用于食品、药物、化妆品和化学工业等各个领域[10-12]。然而，β-葡聚糖的低水溶性限制了其应用效果和范围[13]。为了进一步促进其实际生产应用，研究者采用生物酶解[14-15]、氧化降解等[16]方法，将β-葡聚糖裂解为聚合度较低的低聚糖，从而增加其水溶性，同时保持较高的生物活性及抗氧化功能。但关于β-葡聚糖在葡萄酒酿造中的相关研究未见报道。

本研究以霞多丽(Chardonnay)酿酒葡萄为原料，在酒精发酵前外源性添加不同质量浓度的水溶性β-葡聚糖，利用顶空固相微萃取结合气相色谱质谱联用技术(headspace solid phase micro-extraction combined with gas chromatography-mass，HS-SPME/GC-MS)检测发酵酒样中的挥发性香气化合物，探讨其对霞多丽干白葡萄酒香气品质的影响，以期为水溶性β-葡聚糖在葡萄酒酿造生产应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

霞多丽酿酒葡萄，2020年9月采自甘肃武威莫高酿酒葡萄种植基地，还原糖含量240 g/L，总酸含量6.47 g/L(以酒石酸计)。

Arome White酿酒酵母(S.cerevisiae)，意大利Enartis公司；水溶性β-葡聚糖SG 90，安琪酵母股份有限公司；2-辛醇(色谱纯)，美国Sigma公司；L-苹果酸、纤维二糖、肌醇、维生素B1、维生素B6、生物素等均为国产分析纯，上海源叶生物科技有限公司；柠檬酸、MgSO4、MnSO4、酒石酸氢钾、偏重亚硫酸钠、(NH4)2HPO4、无水葡萄糖、KH2PO4、K2SO4等常规试剂均为国产分析纯，天津光复化工研究所。

1.2 仪器与设备

TRACE 1310-ISQ气相色谱-质谱联用仪，美国Thermo Scientific公司；SPME手动进样手柄、50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头，上海安谱科学仪器有限公司；PHS-3C精密pH计，上海仪电科学仪器股份有限公司；DK-S12电热恒温水浴锅，上海森信实验仪器有限公司；HX502T型电子天平，慈溪市天东衡器厂。

1.3 实验方法

1.3.1 模拟葡萄汁的配制

模拟葡萄汁的配制参考马腾臻[17]的方法。模拟 汁成分(mg/L)：葡萄糖220 000、纤维二糖200、(NH4)2HPO41 500、KH2PO4750、K2SO4500、7H2O·MgSO4250、 CaCl20.117、NaCl 200、L-苹果酸300、柠檬酸200、酒石酸氢钾2 500、偏重亚硫酸钠80、肌醇20、维生素B515、维生素B10.25、维生素B60.25、生物素0.003、维生素B32。

1.3.2 酿酒酵母菌株活化

按产品说明书推荐方法对Arome White酿酒酵母菌株进行活化。将活性干酵母溶于10倍体积无菌水中，37 ℃静置20 min，再加入等体积的霞多丽葡萄澄清汁，28 ℃活化25 min，备用接种。

1.3.3 水溶性β-葡聚糖对酿酒酵母菌株生物量的影响

参考王安娜[18]的方法。在2 L的模拟葡萄汁(2.5 L棕色罐)中分别添加不同质量浓度(100、200、300、400、500 mg/L)的水溶性β-葡聚糖，以未添加水溶性β-葡聚糖为对照组(CK)，按0.2 g/L接种酿酒酵母，25 ℃培养箱控温培养。每隔24 h测定模拟汁中酵母细胞的生物量(OD600)，绘制酿酒酵母菌株生长曲线，比较不同质量浓度的水溶性β-葡聚糖对酿酒酵母菌株生长的影响差异。每个样品设置平行3组，结果取平均值。

1.3.4 葡萄酒微酿实验

葡萄酒酒精发酵工艺如下：

霞多丽酿酒葡萄→筛选、除梗、破碎、除去皮渣→加40 mg/L SO2、20 mg/L果胶酶→低温澄清48 h(4 ℃) →倒灌→澄清汁置于2.5 L棕色发酵罐(添加水溶性β-葡聚糖)→接种酿酒酵母→25 ℃ 恒温发酵→残糖<4 g/L时结束酒精发酵

待酒精发酵结束后，分别取待测酒样于50 mL离心管中，于-20 ℃密封保存待测基本理化指标及挥发性香气化合物，每组处理重复3次。

1.3.5 基本理化指标的测定

参照GB 5009.237—2016《葡萄酒、果酒通用分析方法》的方法进行测定[19]。

1.3.6 挥发性香气成分分析

参照祝霞等[20]的香气物质萃取方法及GC-MS条件，并略作修改。各发酵酒样重复测定3次。

1.3.6.1 香气成分富集

取8 mL待测酒样加入15 mL顶空瓶中，同时添加2.5 g NaCl、10 μL 2-辛醇(质量浓度为81.06 mg/L)，加磁力搅拌转子后封口膜封口并摇匀，放入恒温加热磁力搅拌器中，40 ℃水浴平衡30 min，然后插入萃取针(旋出萃取头)顶空萃取30 min。

1.3.6.2 GC-MS条件

GC条件：色谱柱DB-WAX 60 m×2.5 mm×0.25 μm，进样口温度240 ℃，传输线温度230 ℃，离子源温度250 ℃，不分流进样；载气(He)流速1 mL/min；进样时间5 min；柱温升温程序：40 ℃保持5 min，以3.5 ℃/min升至180 ℃，保持15 min。

MS条件：电子轰击离子源；电子能量70 eV；传输线温度180 ℃；离子源温度200 ℃；质谱扫描范围50～350m/z。

定性定量分析：通过NIST-11、Wiley及香精香料谱库对香气化合物质谱图进行初步检索比对，并结合人工图谱解析进行定性分析，确认各个香气物质的化学成分。对已有标准品的高级醇、酯类和萜烯类等化合物，利用标准曲线(R2>0.995)定量，无标准品的化合物采用化学结构、官能团相似、碳原子数相近的标准物质进行半定量。

1.4 感官评价

感官评价参照GB/T 15037—2006[21]及祝霞等[20]的方法，对酒样进行感官评价。所有酒样进行随机编号，并由10名具有一定葡萄酒品尝经验或经过专业培训的人员(男、女各5人)对酒样进行感官评定。分别从外观(澄清度、颜色强度)，香气(花香、果香、甜味、脂肪味)和风味(酸度、浓郁度、余味长短、平衡感)共10个方面对酒样进行评价，使用10分结构化数值进行量化。0～10分表示感官逐渐增强。

1.5 数据处理及分析

香气物质数据作图用Excel 2010和Origin 2018软件。结果用平均值和标准误表示，并用SPSS 19.0进行主成分分析以及Duncan′s多重差异显著性分析(P< 0.05)。

2 结果与分析

2.1 水溶性β-葡聚糖对酿酒酵母生物量的影响

由图1可知，随着水溶性β-葡聚糖添加量的增加，Arome White酿酒酵母的生长速率呈现先增加后降低的趋势。酒精发酵3 d后，酵母的生长趋于稳定；在发酵至第7 天时，酿酒酵母的OD600值由大到小依次为300 mg/L(2.509)>400 mg/L(2.461)>500 mg/L(2.398)>200 mg/L(2.271)>100 mg/L(2.221)>CK(2.046)，与对照组相比，分别提高了22.68%、20.28%、17.20%、11.00%、8.55%。其中300 mg/L的OD600值最大，分别是100、200 mg/L的1.13和1.10倍。 综合分析，在模拟汁酒精发酵时添加水溶性β-葡聚糖有利于Aroma White酿酒酵母菌株的生长，且添加量为300、400、500 mg/L时效果更好，因此选择这3个质量浓度进行香气化合物分析检测。

图1 水溶性β-葡聚糖对酿酒酵母生物量的影响

2.2 发酵酒样基本理化指标

由表1可知，对照组(CK)的酒精度最高；300 mg/L 处理组葡萄酒的总酸和挥发酸含量显著低于CK(P<0.05)。4个处理组葡萄酒的色度间存在显著差异，其中300 mg/L处理组酒样色度值最低(0.38)，较对照降低了79.3%(P<0.05)。酵母多糖可以“包裹”酒中的多酚，降低其与单宁的作用，在某种程度上增加葡萄酒抗氧化的能力，从而间接的保护了葡萄酒的色泽稳定[22-23]。综合分析，各处理组发酵酒样理化指标均符合GB/T 15037—2006的要求[21]。

表1 酒样基本理化指标

2.3 霞多丽干白葡萄酒香气成分检测

不同处理组酒样的主要香气物质GC-MS检测结果如图2所示。酒样共检测出69种香气化合物，其中酯类35种，醇类20种，酸类5种，萜烯类3种，醛酮类6种。由表2可知，对照组(CK)检出63种香气化合物，总含量为26.22 mg/L，水溶性β-葡聚糖添加组(300、400、500 mg/L)分别检测出64、63、64种香气物质，总量依次为53.71、49.66、45.15 mg/L。

2.3.1 酯类化合物

酯类物质是酒精发酵过程中产生的主要次级代谢产物，分为乙酸酯、脂肪酸乙酯和其他酯类，对葡萄酒的花果香气具有重要贡献[24-25]。由图2可知，酯类物质含量随水溶性β-葡聚糖浓度的增加呈先增加后降低的趋势。其中300 mg/L添加组共检出32种酯类物质，含量是对照组的2.10倍(34.55 mg/L)，其次为400、500 mg/L水溶性β-葡聚糖添加组，含量和种类都为(33.14 mg/L，32种)。

A-酯类物质；B-醇类物质；C-酸类物质；D-萜烯类物质；E-醛酮类物质

实验共检出9种乙酸酯。添加水溶性β-葡聚糖可显著增加葡萄酒中乙酸酯类物质总量，当添加量为300 mg/L时，含量最高(11.46 mg/L)，是对照组的1.93倍。其中乙酸乙酯、乙酸异戊酯、乙酸苯乙酯、乙酸己酯的气味活性值(odor activity value，OAV)>0.1。乙酸乙酯是葡萄酒中重要的香气物质，其含量低于150 mg/L能够增加葡萄酒香气的复杂性，各处理组中乙酸乙酯的含量为0.55～1.14 mg/L，其中300 mg/L添加组中乙酸乙酯的含量最高，是CK的1.66 倍。乙酸异戊酯和乙酸己酯能够为葡萄酒带来香蕉和梨等香气，300 mg/L添加组中这2种酯类物质的含量最高，分别为6.67、1.31 mg/L。 乙酸苯乙酯在各处理组之间均存在显著差异(P<0.05)，且300 mg/L水溶性β-葡聚糖添加组的含量最高，与CK相比，增加了38.46%。

实验共检测出13种脂肪酸乙酯，是酯类物质中种类最多，含量最高的物质。由图2可知，300和400 mg/L 水溶性β-葡聚糖添加组的脂肪酸乙酯含量较高，分别是CK组的2.20和2.35倍。其中，癸酸乙酯(果香，脂肪味)、辛酸乙酯(果香，茴香味)、己酸乙酯(香蕉，青苹果味)、丁酸乙酯(香蕉，菠萝味)等脂肪酸乙酯的OAV>0.1，赋予葡萄酒更浓郁的果香品质。

2.3.2 高级醇类化合物

葡萄酒中的高级醇含量低于300 mg/L时，对葡萄酒香气具有积极的作用[26]。实验共检出20种高级醇类化合物，其中300 mg/L水溶性β-葡聚糖添加组的醇类物质含量最高(17.85 mg/L)，是对照组的2.12倍，400、500 mg/L添加组的高级醇类化合物含量分别为15.38、14.64 mg/L，分别是对照组的1.83和1.74倍。正戊醇、正辛醇和苯乙醇的OAV>0.1。正戊醇为葡萄酒带来杂醇味等独特气味，其中300 mg/L 处理组中含量最高(6.13 mg/L)，是CK的1.66倍。

2.3.3 酸类化合物

酸类物质大部分来源于酵母菌和乳酸菌代谢的副产物[27]。实验共检出5种酸类化合物，由图2-C可知，添加水溶性β-葡聚糖显著降低了葡萄酒中酸类物质含量(P<0.05)，500 mg/L添加组的酸类物质含量最低(0.70 mg/L)，与对照组相比，降低了40.17%。 300、400 mg/L添加组的酸类物质含量分别为0.83、0.78 mg/L，分别比对照组降低了29.06%和33.33%。所检测到的5种酸类物质中，辛酸的含量比对照组降低了7.4%～19.5%，有利于减轻葡萄酒的酸败味和脂肪味。

2.3.4 萜烯类化合物

酒样中共检测出香茅醇、芳樟醇和大马士酮3种萜烯类物质。其中300 mg/L处理组的萜烯类物质总量最高(0.065 mg/L)，是CK组的2.27倍。其次为300、400 mg/L处理组，分别比对照组提升了33.21%和12.31%。芳樟醇和大马士酮含量为0.014、0.022 mg/L，相比于CK组分别提升了9.7%、36.8%，能够为葡萄酒提供一定的玫瑰花香和甜香[28-29]。

2.4 香气成分的主成分分析

由于酒样中检测到的挥发性香气物质种类繁多，含量差异较大。为综合分析添加不同质量浓度水溶性β-葡聚糖的产香特征，故对香气化合物中OAV>0.1的物质进行主成分分析(principal component analysis，PCA)，并以特征值大于1进行主成分抽提，得到PC1和PC2贡献率分别为52.916%和28.586%。 2个主成分累计解释总方差81.503%，即这2个主成分能基本反映原数据全部的变异(图3、图4)。

图4 香气化合物PCA的样品分布图

由图3可知，乙酸苯乙酯(花果香)、乙酸己酯(果香)、辛酸乙酯(果香)、苯乙醇(玫瑰香，花香)、乙酸乙酯(香蕉味，果香)等物质在PC1正半轴上的得分较高，即反映了葡萄酒中的花香和果香特征；异丁酸(脂肪味)、辛酸(奶油味)、丁酸(奶酪味)等物质在PC1负半轴的得分较高，即反映了脂肪味等不良的香气特征；芳樟醇(柑橘味，果香)、大马士酮(花香)等物质在PC2正半轴得分较高，即反映了花果香等香气特征；癸醛(柑橘味，果香)、丁酸乙酯(香蕉，果香)、己酸乙酯(青苹果，果香)等物质在PC2负半轴得分较高，即反映了果香等香气特征。

图3 香气化合物主成分分析的因子载荷图

由图4可知，处理组酒样的香气特征可在这2个主成分所形成的二维平面上被很好地分开，其中300 mg/L 处理组在PC1、PC2正半轴有较高得分，主要体现了脂肪酸乙酯和乙酸酯类物质的香气信息，因而其酒样的花香、果香特征突出；400、500 mg/L处理组酒样香气特征相似，均在PC1正半轴有较高得分，但PC2得分较低，该区域突出的香气特征是花香以及微弱的果香味。CK分布在PC1的负半轴区域，该区域最突出的香气特征是脂肪味，且CK处理酒样与其他处理组差异较大。综合分析可知，酒精发酵前添加水溶性β-葡聚糖有利于改善葡萄酒香气品质单一、特点不突出等问题。

2.5 感官评价结果

由图5可知，添加不同质量浓度的水溶性β-葡聚糖对葡萄酒感官评价的影响不同。CK组酒样中，除澄清度评分较高外，其余指标评分均较低。从香气(花香、果香、甜味、脂肪味)方面分析，添加水溶性β-葡聚糖能明显增强酒样的花香、果香和甜味特征，降低酒样的脂肪味。整体来看，与CK组相比，添加水溶性β-葡聚糖更有利于提升葡萄酒的果香和花香特征，特别是300 mg/L处理组，可显著改善葡萄酒的香气特征。

图5 霞多丽干白葡萄酒感官分析雷达图

3 结论

实验以霞多丽酿酒葡萄为原料，利用HS-SPME/GC-MS检测外源性添加不同质量浓度的水溶性β-葡聚糖，对发酵酒样中挥发性香气化合物的影响。结果显示，水溶性β-葡聚糖能显著增加葡萄酒中香气物质的含量(P<0.05)；其中添加300 mg/L的水溶性β-葡聚糖能够显著促进葡萄酒中醇、酯类物质的合成；主成分分析结合感观分析结果表明，与对照组和其他处理组相比，300 mg/L组葡萄酒的花香和果香特征明显增强提高了葡萄酒的感官品质。研究结果可为提升霞多丽干白葡萄酒香气品质提供理论支持，但其对葡萄酒发酵香气的影响机制还有待进一步研究。