七珠胶囊对CCl4致大鼠慢性肝损伤的保护作用及机制研究*

李涛 陶山 李倩 郭东艳 范妤*

(1.陕西中医药大学基础医学院，陕西 咸阳 712046；2.陕西省中药基础与新药研究重点实验室，陕西 咸阳 712046)

七珠胶囊是由太白楤木、湖北海棠、叶下珠3味中药组成，具有解毒祛湿、疏肝止痛的功效，方中太白楤木驱风除湿、利水消肿、止痛、健脾，常用于治疗急慢性肝炎、风湿性关节炎、淋巴结肿大、糖尿病等[1]；湖北海棠养肝和胃、消积化滞，常用于急慢性肝损伤，慢性肝炎，脂肪肝治疗[2-3]；叶下珠平肝清热、利水解毒，用于治疗传染性肝炎、肾炎水肿、尿路感染、无名肿痛等[4]。三药配伍，共奏解毒祛湿、疏肝止痛的功效。课题组前期对其有效部位的提取及纯化工艺进行了筛选[5-10]，本实验是在前期研究的基础上，以太白楤木总皂苷、湖北海棠总黄酮、叶下珠总多酚三个有效部位为原料进行配伍组方，通过腹腔注射40%CCl4橄榄油溶液复制慢性肝损伤大鼠模型，确定七珠胶囊的抗肝损伤作用，从氧化应激和炎症反应两方面探究其保肝作用靶点及其作用机制，为七珠胶囊的保肝作用研究提供理论依据。

1 材料与仪器

1.1实验动物 SD大鼠60只，雄性，体质量180～220 g，SPF级，由西安交通大学医学部实验动物中心提供，实验动物质量合格证号：SCXK(陕)2012-003。在室温(25±2)℃下饲养，所有大鼠均自由摄食且不限饮水。

1.2实验药物 太白楤木药材购于陕西眉县药材公司，经陕西中医药大学王继涛高级实验师鉴定为五加科(Araliaceae)植物太白楤木(Aralia taibaiensis)的根皮；湖北海棠药材购自湖北神农架药材公司，经陕西中医药大学王继涛老师鉴定为苹果属(MalusMill.)湖北海棠(Malushupehensis(Pamp.)Rehd)的干燥叶；叶下珠药材购自陕西昊源中药饮片有限公司，经陕西中医药大学王继涛高级实验师鉴定为大戟科叶下珠属植物叶下珠(Phyllanthusurinaria)的干燥全草；联苯双酯滴丸(浙江医药股份有限公司新昌制药厂，批号：20140818)；四氯化碳(天津天士力化学试剂有限公司，批号：20140228)；橄榄油(广州花之王化工有限公司,批号：20140528)，其它试剂均为分析纯。

1.3试剂与仪器 ALT试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号：20150723)，AST试剂盒(南京建成生物工程研究所,批号：20150519)，BAC蛋白定量试剂盒(南京建成生物工程研究所,批号：20150514)，超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号：20150518)，丙二醛(MDA) 测定试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号：20150404)，谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号：20150908)，兔抗TNF-α(武汉三鹰生物技术有限公司，货号：60291-1-lg)、NF-κB多克隆抗体(美国Cell Signaling公司，货号：#4764)，免疫组化染色试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司，批号：20150618)。

Centrifuge 5417R台式冷冻高速离心机(Germany Eppendorf)，JJ-2组织捣碎匀浆机(金坛市富华仪器有限公司)，HHS-4A电热恒温水浴锅(沪越实验仪器厂)，JA2003型电子分析天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司)，BIO-RAD Model680酶标仪(北京伯乐生命科学发展有限公司)，JJQ-P2016J生物组织切片机(武汉俊杰电子有限公司)，ZEISS显微镜(德国蔡司公司，型号ImagerA1)，BIO-RAD电泳仪(北京伯乐生命科学发展有限公司)。

2 方法与结果

2.1方法

2.1.1分组及给药 取SD大鼠60只，随机分为6组，即空白对照组、模型组、阳性对照组、七珠胶囊高、中、低剂量治疗组，每组10只，置于温度(25±1)℃，相对湿度(40%～65%)的实验室，适应性饲养7 d后试验。将楤木总皂苷0.08 g·kg-1：海棠总黄酮0.30 g·kg-1：叶下珠总多酚0.22 g·kg-1组合分别为为给药高剂量(1.2 g·kg-1)组，中剂量(0.6 g·kg-1)组，低剂量(0.3 g·kg-1)组。除空白对照组外，其余各组大鼠给予腹腔注射40%CCl4橄榄油溶液(容积为3 mL·kg-1，2次/w，周一、周五各1次，连续8周。从造模第1日起，空白对照组和模型组给予等体积生理盐水；阳性对照组在造模同时给予联苯双酯滴丸水溶液(0.5 g·kg-1)治疗；治疗组在造模同时给予七珠胶囊水溶液治疗，1次/d，连续8 w。

2.1.2取材 末次注射CCl416 h后，戊巴比妥5 mg/100g 腹腔注射麻醉大鼠，蛙板固定大鼠，腹主动脉取血，收集血液，3000 r·min-1离心10 min取上清，分离血清，-20 ℃保存；同时立即剖取肝脏，取0.5 g肝组织，剪碎，放于玻璃匀浆器中，加预冷的9倍体积的0.9%生理盐水，2500 rmp离心10 min，上清液-20 ℃保存备用[11]；最大叶肝组织浸泡于10%甲醛溶液中固定；其余肝组织-80 ℃保存，用于提取总蛋白。

2.1.3肝脏指数的检测 实验结束后，称量体质量后麻醉取肝脏并称重肝质量，计算肝脏系数=(肝质量/体质量)。

2.1.4血清中 ALT、AST含量检测 腹主动脉取血，分离血清，置-20 ℃保存，酶标仪检测血清中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)含量。

2.1.5肝脏组织HE染色染色 取肝组织置于10% 福尔马林溶液中固定24 h，乙醇梯度脱水，石蜡包埋，切片，进行苏木素-伊红HE染色，严格按照试剂盒说明书步骤操作。光镜下观察肝组织病理学变化。

2.1.6肝组织抗氧化指标的检测 按照试剂盒说明书操作说明，检测肝组织匀浆中SOD、GSH-Px、 MDA活性的变化。

2.1.7Western-blot检测肝组织TNF-α、NF-κB表达及含量变化 提肝组织取总蛋白，蛋白定量后，按照制胶、上样、电泳、转膜、封闭、一抗二抗孵育、显色、显影、定影、照相、分析的步骤操作，检测肝组织中TNF-α、NF-κB的表达。结果使用Adobe Photoshop 7.0软件测定平均灰度值，计算TNF-α、NF-κB蛋白的相对表达量。

2.1.8统计学方法 采用SPSS11.0软件进行统计学处理，组间比较采用方差分析。P<0.05有统计学意义。

2.2结果

2.2.1七珠胶囊对CCl4致慢性肝损伤大鼠肝脏指数的影响 与模型组比较，七珠胶囊各治疗组均不同程度降低肝脏指数，与模型组相比均有显著差异(P<0.01)，结果见图1。

注：与空白对照组相比1)P<0.01；与模型组相比2)P<0.01

肝脏指数的影响(n=10)

2.2.2七珠胶囊对CCl4致大慢性肝损伤大鼠血清转氨酶活性的影响 与空白对照组比较，模型组大鼠血清中ALT、AST活性明显升高，有显著性差异(P<0.01)。与模型组比较，阳性组和七珠胶囊高、中、低治疗组血清ALT、AST活性均能降低，统计学差异显著(P<0.05)。结果见图2。

2.2.3七珠胶囊对CCl4致大慢性肝损伤大鼠肝组织形态影响 HE染色显示，空白对照组大鼠肝脏小叶结构完整，肝细胞绕中央静脉放射状排列，未发生纤维增生及炎细胞浸润；模型对照组大鼠肝小叶结构破坏，中央静脉粗大，肝脏胶原纤维条索分割、围绕肝小叶排列，形成假小叶，肝细胞坏死严重、脂肪变性，大量炎细胞浸润；与模型组进行比较，七珠胶囊治疗组均不同程度改善大鼠肝组织损伤，变性、坏死肝细胞减少，炎细胞浸润减少。结果见图3。

2.2.4七珠胶囊对CCl4致慢性肝损伤大鼠肝组织SOD、GSH-Px活性和MDA水平的影响 与空白对照组相比，模型组肝组织匀浆中SOD和GSH-Px活性降低显著(P<0.01)， MDA含量显著升高(P<0.01)；与模型组相比，七珠胶囊低、中、高剂量组及阳性组均可不同程度地提高肝组织中SOD和GSH-Px活性，降低MDA含量(P<0.01)，结果见表1。

注：与空白对照组相比1) P<0.01；与模型组相比2)P<0.01，3)P<0.05

图3 七珠胶囊对CCl4致大鼠慢性肝损伤肝组织形态学变化的影响(HE染色，×200)

2.2.5七珠胶囊对CCl4致慢性肝损伤大鼠肝组织TNF-α、NF-κB蛋白表达的影响 Western-blot结果显示：空白对照组大鼠肝组织中TNF-α、NF-κB表达较少，模型组TNF-α、NF-κB蛋白表达增多。与模型组比较，七珠胶囊各治疗组肝组织TNF-α、NF-κB表达减少，统计学差异显著(P<0.01)。结果见图4。

注：与空白对照组相比1) P<0.01；与模型组相比2)P<0.01，3)P<0.05

3 讨论

CCl4诱导复制慢性肝损伤动物模型是一种经典的造模方法[12-14]，CCl4造模途径多样，病理特征稳定，已广泛用于研究慢性肝损伤、肝纤维化发生的细胞及分子机制、血清学标志物与组织病理的相关性及抗慢性肝损伤的药效评价[15-17]。肝细胞受损时胞质内合成的AST、ALT大量释放入血，血液AST、ALT活性变化与肝损伤程度呈正相关，是目前公认的判断肝损伤程度最敏感的血清学指标。本实验结果显示，七珠胶囊高、中、低剂量治疗组均能够显著降低慢性肝损伤大鼠血清中AST、ALT活性，降低肝脏脏器指数；肝组织HE染色和Masson染色观察，与模型组比较七珠胶囊治疗组大鼠肝组织炎细胞浸润减少，肝细胞坏死及肝小叶结构有不同程度改善，肝组织纤维沉积显著减少。表明七珠胶囊能够有效缓解CCl4所致的慢性肝损伤及其早期肝纤维化，具有较好的保肝作用。

CCl4被肝细胞内微粒体酶活化为三氯甲基自由基(·CCl3)，后者与氧结合生成的CCl3OO-·引发脂质过氧化反应，CCl3OO-·可破坏肝细胞膜磷脂层结构，膜通透性增高，同时促使细胞内脂质过氧化反应的终产物MDA增多，与自由基一起协同加重肝损伤程度[18]。CCl4还能够抑制“内源性”抗氧化剂SOD和GSH-Px活性，破坏机体自由基生成与清除的动态平衡，过量的自由基在体内蓄积，上调体内氧化应激水平，进一步损伤肝细胞结构和功能，引发肝组织局部炎症反应，改变肝组织结构及功能[19]。本研究结果表明，七珠胶囊各治疗组能够显著提高大鼠血清SOD、GSH-Px活力，减低MDA含量，促进体内自由基清除，减轻肝细胞损伤，抑制MDA生成，提示七珠胶囊防治肝损伤作用与抑制体内氧化应激反应密切相关。

TNF-α是由单核细胞及巨噬细胞分泌的17 KD非糖蛋白，是重要的促炎因子[18]。TNF-α参与CCL4致化学性肝损伤作用主要原因是激活了中性粒细胞，进而促进其吞噬、氧爆发等效应，活化NF-κB。一般情况下，NF-κB P65/P50-IκB三聚体位于胞质处于未活化状态，NF-κB是能够被氧化应激激活的重要炎症转录调控因子[20]，当细胞受到自由基、内毒素、细胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-1等)等刺激因素作用时，激活蛋白激酶(IKKs)使IκB磷酸化，三聚体解离，NF-κB P65/P50转位入核，与核内ARE组件结合，κB位点结合可增强TNF-α基因转录，使TNF-α产生及释放增多并且炎性细胞被激活，进一步激活了NF-κB，形成了一个正反馈调节，炎症反应不断放大[21]。在实验中我们采用Western-blot法检测大鼠肝组织中NF-κB P65及TNF-α的表达，结果显示，CCl4可导致NF-κB P65在肝组织中TNF-α表达增多，提示肝纤维化发生发展过程中伴随着肝组织炎症反应，七珠胶囊能够有效抑制肝细胞NF-κB的核转位，减少TNF-α合成，通过调控TNF-α/NF-κB信号通路，抑制肝纤维进程中炎症反应。

综上所述，七珠胶囊对CCl4诱导的大鼠慢性肝损伤具有明显保护作用，其作用机制可能与减轻氧化应激损伤、调控TNF-α/NF-κB通路抑制炎症反应密切相关，本研究将为七珠胶囊制剂的临床开发应用提供研究基础和理论依据。