自噬的分子机制及其在心脏骤停脑损伤中的作用研究进展

胡星平，秦开秀

（重庆医科大学附属第二医院急诊科，重庆 404006）

心脏骤停是指心脏射血功能突然终止，重要器官出现严重缺血、缺氧，导致生命终止的一种急性疾病。大多数心脏骤停患者死于急性事件，但大部分心脏骤停死亡发生在心肺复苏成功后的患者中。脑组织对缺血缺氧极其敏感，心脏骤停不仅可损害全身器官系统，还可对神经系统造成严重损伤。心脏骤停后脑损伤是导致患者高死亡率的关键因素之一。有证据表明，心脏骤停脑损伤会引起患者死亡，院外患者死亡率为68%，院内患者的死亡率为23%[1]。因此，探讨心肺复苏后脑损伤的相关机制，寻找改善神经功能新的治疗靶点十分必要。自噬广泛存在于正常的生理过程中，可清除细胞废物，促进结构重建与细胞的生长分化，同时也参与多种疾病的病理过程。近年来，自噬作为一种新的程序性细胞死亡方式，越来越受到国内外学者的重视。现将自噬与心脏骤停患者心肺复苏后脑损伤的机制综述如下。

1 自噬

1962年，Ashford和Porter在显微镜下观察到细胞“自己吃自己”的现象。1963年，比利时生物学家Christian de Duve正式将此现象命名为“自噬”。自噬是指真核细胞通过溶酶体降解来消除细胞质物质的进化机制，其是发生在所有真核细胞中的主要降解途径。细胞自噬是一种不同于凋亡的程序化细胞内降解机制，细胞可通过溶酶体降解自身胞质成分来实现自身的代谢需要和某些细胞器的更新，从而维持细胞内环境稳态。自噬参与多脏器功能的保护与损害，且与机体外各种刺激相关，是全球研究热点。自噬是一把“双刃剑”，在不同的应激状态下作用各不相同，既可对机体起保护作用，也会导致机体进一步损伤。

2 自噬的分类

自噬可根据细胞将内容物运输至溶酶体腔内的3个不同途径分为微自噬、分子伴侣介导的自噬（CMA）及大自噬。微自噬是内容物被溶酶体直接吞噬的降解过程；CMA主要依赖于胞浆内分子伴侣hsc70对带有KFERQ序列的内容物的识别与结合，结合形成的复合物与溶酶体相关的膜蛋白2（LAMP2a）再结合，将内容物运输至溶酶体中被降解；大自噬依赖于双膜囊泡，即内容物在双膜囊泡内被隔离，形成一个自噬体，随后与溶酶体或液泡融合使其降解，也就是形成所谓的自溶酶体[2]。大自噬是自噬最普遍的形式，是一种进化保守的动态途径。大自噬在正常生理水平上发挥作用，可保护包括内质网和线粒体在内的几个亚细胞室的结构和活性。因此，在没有外界干扰的情况下，神经元的存活需要中枢神经系统中具有正常的自噬功能。大自噬不足或过量，都会严重损害细胞的生理功能，故需要进行适当的调控。

3 调节自噬的信号通路

3.1 依赖mTOR信号通路

mTOR是雷帕霉素（rapamycin）或西罗莫司（sirolimus）分子的靶标，是一种不典型的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，属于磷酸肌醇激酶3（PI3K）相关激酶家族的一种，其可与多种蛋白相互作用，形成雷帕霉素复合1（mTORC1）和雷帕霉素复合2（mTORC2）两个不同的复合物。mTORC1促进蛋白质与脂质的合成、细胞生长与合成代谢，其可通过阻止自噬抑制细胞分解代谢；相反，mTORC2调节细胞存活、细胞增殖及代谢。与自噬有关的主要是mTORC1，且mTORC1负反馈调控自噬。mTORC2可通过激活mTORC1间接抑制自噬。在营养丰富的条件下，哺乳动物中的mTORC1通过直接磷酸化和抑制由unc-51样激酶1（ULK1）、自噬相关基因13（ATG13）与FIP200组成的蛋白复合物来调控自噬。相反，营养物缺乏也可刺激ULK1/ATG13/FIP200复合物的形成，并通过ULK1自身磷酸化及其结合配偶体的磷酸化启动自噬[3]。

3.1.1 AMPK-mTOR信号通路 AMPK-mTOR是参与自噬调节的主要信号途径之一。AMP活化蛋白激酶（AMPK）是一种代谢应激敏感酶，负责维持细胞能量稳态，腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）产量轻微下降时会导致一磷酸腺苷（AMP）或二磷酸腺苷（ADP）的相对增加，此时AMPK会被激活。AMPK作为一种重要的生理能量传感器，激活后可以诱导自噬，其调控的主要机制是AMPK直接磷酸化T1227和S1345上的结节性硬化症基因2（TSC2，也被称为结核素），增强Rheb-GAP活性，从而抑制哺乳动物mTORC1[4]。AMPK也能够通过磷酸化mTORC1结合伙伴raptor，从而负向调控mTOR。

3.1.2 PI3K-Akt-mTOR信号通路 磷脂酰肌醇3-激酶(P13K)是一类脂质激酶，可根据其不同的结构和脂质底物分为三类（第Ⅰ类、第Ⅱ类及第Ⅲ类），而与自噬有关的主要是第Ⅰ类。PI3K是酪氨酸激酶受体的底物，其可导致丝氨酸苏氨酸蛋白激酶（Akt）磷酸化，进而调节细胞存活。PI3K活化导致Akt磷酸化，随后磷酸化的Akt促进mTOR信号通路的磷酸化和活化。Akt磷酸化触发结节性硬化症基因1/2（TSC1/2），进而刺激mTOR抑制下游自噬启动激酶ULK1，导致自噬终止[5]。

3.2 非mTOR信号通路

3.2.1 ROS-自噬信号通路 活性氧（ROS）主要包括一系列含氧的高活性物质，如氧阴离子、自由基及过氧化氢（H2O2）。随着氧化应激反应的升高，ROS的过量产生会分别激活缺氧诱导因子（HIF-1）、肿瘤抑制蛋白（p53）、转录因子叉头蛋白3（FOXO3）及细胞转录因子NF-E2相关因子2（NRF2），分别诱导凋亡线粒体蛋白（BNIP3）、NIX基因、肿瘤蛋白53诱导的糖酵解和凋亡的调控子（TIGAR）、微管相关蛋白轻链3（LC3）、BNIP3及p62蛋白的转录，最终促使相应蛋白产物在细胞质中诱导自噬[6]。研究发现，ROS可以通过转录因子EB（TFEB）调节自噬，TFEB是溶酶体生物发生和自噬的主要调控因子，通过线粒体损伤或外源性增加ROS水平，直接激活MCOLN1，诱导溶酶体Ca2+释放，触发PPP3/钙调蛋白依赖的TFEB核易位，增强自噬[7]。

3.2.2 PKC-自噬信号通路 蛋白激酶C（PKC）是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，以细胞类型特异性的方式调控多种细胞功能，其活性又受丝氨酸/苏氨酸和酪氨酸磷酸化调控。PKC是一种自噬调节剂，可以通过介导细胞成分的自噬来帮助维持细胞稳态。研究表明，PKC通过调节下游的raf1和JNK信号而激活自噬[8]。但也有研究表明，PKC抑制剂可触发自噬，而PKC激活剂可抑制饥饿或雷帕霉素诱导的自噬[9]。

3.2.3 内质网应激- 自噬信号通路 内质网应激是一种常见的细胞应激反应，不同的细胞压力，如Ca2+稳态的扰动、氧化还原失衡及蛋白质折叠缺陷等，均会导致未折叠或错误折叠的蛋白质在内质网（ER）腔内积聚。内质网应激会引发自噬，细胞在内质网应激下，激活一系列互补的适应机制，以应对蛋白折叠的改变，称为未折叠蛋白反应（UPR）。UPR是一种高度保守的机制，使细胞能够响应和解决内质网应激。UPR的3个典型分支在诱导、囊泡成核和伸长的不同阶段调节自噬，导致Beclin-1/Bcl-2复合物的破坏，从而释放出自噬基因Beclin-1，或通过x-box绑定蛋白1（XBP-1）介导的转录因子激活Beclin-1[10]。

3.2.4 C9orf72-自噬信号通路 9号染色体开放阅读框72（C9orf72）参与中枢神经系统（CNS）大自噬的微调。有报道指出，C9orf72在自噬中的作用为C9orf72下调后可导致自噬起始的减少[11]。C9orf72可影响FIP200/ULK1自噬起始复合物的功能，但也可能调节mTOR信号通路和TFEB，从而促进自噬。

4 自噬在脑损伤中的保护作用

4.1 激活自噬机制

研究发现，通过雷帕霉素治疗可显著增加自主循环恢复（ROSC）后LC3-Ⅱ和Beclin-1的表达，促进神经元存活，减少神经元凋亡，改善心肺复苏后神经功能缺损评分[12]。在心脏骤停后轻度亚低温是唯一可以改善神经系统预后的治疗。肖盐等[13]通过建立SD大鼠窒息性心脏骤停- 心肺复苏模型，运用蛋白质印迹法检测自噬相关蛋白Beclin-1和LC3、凋亡相关蛋白Bcl-2和caspase-3、Ⅲ型PI3K通路蛋白Vps34和Atg14，透射电镜观察脑组织超微结构的变化，并在ROSC后48 h进行神经功能缺损评分（NDS）评估，结果显示，亚低温治疗可减轻心肺复苏后脑水肿，改善脑功能，其可能与激活Ⅲ型PI3K通路增加自噬、抑制凋亡调节有关。脂联素（APN）可通过降低心脏骤停- 心肺复苏诱导的GCIR小鼠脑组织中裂解的caspase-3的表达来抑制细胞凋亡，并促进抗凋亡蛋白Bcl-2的表达。研究证明，APN通过促进自噬保护神经元免受损伤诱导的过度凋亡，可能机制是通过激活AMPK和减轻氧化应激来促进钙- 心肺复苏后的神经元自噬[14]。此外，ZHU等[15]应用二甲双胍预处理模型大鼠，观察心脏骤停后继发脑损伤的情况，发现二甲双胍通过增加AMPK依赖性自噬，对心肺复苏后缺血性脑损伤具有神经保护作用。

4.2 抑制自噬机制

也有研究证实，亚低温治疗可通过抑制自噬与神经元凋亡来减轻心肺复苏后脑损伤；在关于右美托咪定在脑缺血再灌注损伤的研究中发现，右美托咪定治疗可通过抑制自噬与诱导低温，减少神经元损伤，改善神经功能[16]。CUI等[17]在8 min 心脏骤停后心肺复苏大鼠模型中，研究自噬和p53信号通路是否在脑缺血再灌注损伤（I/R）后海马神经元凋亡中发挥作用；通过检测心脏骤停后组织蛋白酶B、D、Beclin-1、p53、自噬调节剂（DRAM）、Bax、凋亡调节剂（PUMA）的变化，说明自噬激活部分由p53介导，并参与心脏骤停后海马神经元凋亡，自噬抑制剂3-MA和溶酶体抑制剂BFA均能抑制心脏骤停后的自噬和凋亡活化，促进神经存活。p53-specific抑制剂PFT-α和自噬抑制剂3-MA可有效抑制DRAM和LC3-II的表达，从而发挥神经保护作用。在其他干预措施，如硫化氢在心肺复苏后脑保护的作用研究中，抑制ROSC后神经元自噬，可减少神经元凋亡、改善神经功能也得到证实[18]。此外，在乌司他丁、核糖核酸酶（RNase）、松属素（Pinocembrin）等对心脏骤停后神经功能的影响的相关研究中发现，降低自噬水平，可改善神经功能评分、提高记忆和学习能力[19-20]。

5 小结与展望

自噬是生物体高度保守进化的生理机制，主要维持细胞和机体的稳态作用，在应激条件下发挥着重要的调节作用。自噬在心脏骤停- 心肺复苏中，参与脑损伤的过程，其过程复杂，机制尚不明确。在生理状态下，自噬处于较低水平，可作为机体的一种自我修复机制。在心脏骤停- 心肺复苏的脑损伤中，初始阶段自噬被激活，能够清除或者抑制神经元损伤相关物质，或者激活脑保护机制，从而达到神经保护作用。相反，过度激活自噬，可能促发神经元非凋亡程序性死亡，从而导致神经元凋亡与神经功能损伤。可见，在心脏骤停- 心肺复苏中发生自噬与过度自噬，其作用截然相反，发生这种现象可能与动物模型的年龄、造模方法、脑损伤时间以及观察相关指标的时间不同有关。因此，自噬在同一种疾病中发挥的作用机制也不相同。在心脏骤停- 心肺复苏脑损伤中，自噬通常为大自噬，其自噬的发生主要依赖mTOR通路，也有部分依赖非mTOR通路，其介导的信号通路和参与的蛋白种类多，机制复杂。因此，需要对心肺复苏脑损伤中自噬的机制和信号通路进一步研究，期望可以通过对自噬进行调控，从而降低心脏骤停后患者的致残率、死亡率，改善幸存者的神经功能与生存质量，使自噬在不影响其他生命活动的同时发挥良好的神经保护作用。