血浆肾素水平评价方法的研究进展

秦飞，祝珊珊，陈丹，许莉

(厦门医学院，福建 厦门 361023)

高血压是一个全球性的公共卫生问题。我国高血压患者约2.45 亿，目前患病率仍呈上升趋势，知晓率、治疗率、控制率却较低[1]。高血压如不及时治疗会导致脑血管疾病、心脏疾病、肾脏疾病、糖尿病等。因此，早期发现与治疗对预防相关慢性疾病至关重要。肾素-血管紧张素-醛固酮(RAAS)系统是调节人体水、电解质平衡以及血容量、血管张力和血压的激素链之一，RAAS系统失调将导致肾性高血压、内分泌型高血压，其主要调控因素肾素的检测，在高血压的诊断中发挥着重要作用。肾素是肾脏球旁复合体的球旁细胞释放的一种蛋白水解酶，分子量为37 kD，肾素分子结构复杂以及低丰度的特征，使其检测变得困难，目前尚没有标准化的检测方法。因此建立与完善一种易于操作、耗时较短、结果可比的标准化方法在肾素的临床检测中具有重要意义。

1 肾素水平评价的临床意义

肾素是RAAS系统的主要调控因素，当血压降低时，肾脏分泌肾素释放到血液中，肾素催化肝脏分泌的血管紧张素原水解产生血管紧张素Ⅰ(Ang-Ⅰ)，Ang-Ⅰ经过肺、肾等脏器时，经血管紧张素转化酶剪切C-末端两个氨基酸残基生成血管紧张素Ⅱ(Ang-Ⅱ)。Ang-Ⅱ具有高效的收缩血管作用，使血压升高；Ang-Ⅱ也能刺激肾上腺皮质分泌醛固酮，醛固酮能促进肾脏对水和钠离子的重吸收，继而增加体液容量，升高血压。因此血浆肾素活性测定对于明确高血压的发病机制、指导治疗和评价预后有参考价值。崔淑娴等[2]比较了高血压合并焦虑抑郁患者和原发性高血压患者的血浆肾素活性、醛固酮水平及血压变异性，发现高血压并焦虑抑郁患者卧位、立位血浆肾素活性及醛固酮水平明显高于原发性高血压患者，提示RAAS激活参与了焦虑抑郁患者的高血压发病过程，为降压药物的选择提供了理论依据，降压药物选用长效RAAS抑制剂为最佳。吴冰等[3]研究了血浆醛固酮/肾素浓度比值(ADRR)对原发性醛固酮增多症(PA)的诊断价值，结果表明，ADRR可作为筛查PA的一种有效指标，并建议用25作为立位ADRR初筛的临界值。李宁等[4]研究了尿醛固酮/血浆肾素活性比值(UARR)在PA筛查中的价值，立位UAPP的最佳临界点为5.1 ng·mL-1·h-1，灵敏度为92.13%，特异度为91.18%，结果表明，立位UARR也是一种有效的PA筛查指标。2016年的中国《原发性醛固酮增多症诊断治疗的专家共识》[5]以及同年美国内分泌协会更新的原发性醛固酮增多症临床实践指南[6]均建议用醛固酮/肾素比值来进行PA的初筛和诊断，其中肾素的检测包括两种方法，肾素活性(PRA)以及肾素浓度(PRC)，前者通过测定Ang-Ⅰ的产生速率来反映肾素活性，后者则是直接测定血浆肾素浓度。

2 肾素活性检测方法

PRA检测的常规步骤是在一定温度和pH值条件下孵育血浆，使血管紧张素原在肾素作用下转化为Ang-Ⅰ，同时加入血管紧张素转化酶抑制剂，抑制Ang-Ⅰ进一步转化为Ang-Ⅱ，而后通过冰浴或化学方法终止反应，测定Ang-Ⅰ的生成量，结合孵育时间计算PRA，Ang-Ⅰ的产生速率越快则肾素活性越强。其中，Ang-Ⅰ的定量方法主要有免疫学分析法和质谱法。

2.1 免疫学分析法

1969年Boyd等[7]首先提出将放射免疫法(RIA)用于PRA的评价，经过几十年的改进，RIA已成为临床实验室常用方法。该方法以125I标记的Ang-Ⅰ作为竞争抗原，通过竞争结合来定量待测样品中的Ang-Ⅰ。RIA法发展较早，技术成熟，但实际应用中仍存在明显的问题。首先RIA检测Ang-Ⅰ是基于竞争性结合原则，所使用的抗体同时可以与其他内源性血管紧张素进行非特异性结合，这种潜在的交叉反应性会高估肾素活性。此外，RIA法还存在难以自动化、线性范围窄、产生放射性污染等问题，临床应用中有一定的局限性。酶联免疫吸附法(ELISA)检测PRA也有报道，但是该方法的灵敏度不如RIA，限制了其实际应用[8]。

2.2 质谱法

质谱法的高特异性、高灵敏度、低检测限等优势使其在医学检验领域的应用越来越广泛，在血液或体液中氨基酸、肽、维生素、激素、血药浓度、微量元素等微量或恒量物质的定性定量检测中都有应用。用于PRA评价的质谱方法主要有两种：电喷雾质谱(LC/ESI-MS/MS)和免疫基质辅助激光解离质谱(iMALDI-MS)。前者在孵育结束后对Ang-Ⅰ进行固相萃取，再通过液相色谱洗脱后直接测定Ang-Ⅰ浓度；后者在孵育结束后首先用抗体修饰的磁性颗粒捕获Ang-Ⅰ，通过磁分离后，再用MALDI质谱进行定量。徐雯等[9]建立了血浆PRA的液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)检测方法，该方法的特异性、重复性、基质效应等均在临床可接受范围，定量下限为0.084 4 ng·mL-1·h-1，线性范围为0.084 4～30.000 0 ng/mL，线性相关系数r2=0.99，与RIA结果相比，两者结果一致性较好；RIA的诊断特异性(99.4%)优于LC-MS/MS(91.0%)，但灵敏度(33.3%)远不及LC-MS/MS(96.3%)。该方法目前已在复旦大学附属中山医院临床应用。Camenzind等[10]建立了PRA的iMALDI-MS分析方法，与RIA及LC-MS/MS的检测结果均表现出良好的相关性(iMALDI-MS与RIA，r2=0.941 2；iMALDI-MS与LC-MS/MS，r2=0.947 1)，与RIA法相比，iMALDI-MS的优势是通过抗体富集Ang-Ⅰ，不存在放射性污染；富集后再使用质谱对特定目标物分子量进行筛选检测，消除了非特异性吸附的影响，克服了RIA的最大不足。与免疫学分析方法相比，质谱检测的灵敏度更高、分析时间更短，且无需用到放射性核苷酸。但质谱仪器价格昂贵并需要专人操作维护，且测量性能远不能满足国际临床化学与检验医学联合会对参考方法测量性能的要求[11]，在方法标准化方面仍需要进行大量探究工作。

3 肾素浓度检测

化学发光免疫法(CLIA)是近年来发展起来的PRC检测方法，检测原理是基于双抗夹心，抗体一为包被在磁微粒上的能识别肾素的特异性单克隆抗体，抗体二为结合了发光底物的肾素特有的单克隆抗体，待测物与两种抗体同时加入反应体系进行孵育后冲洗，同时结合两种抗体的被测物，在催化剂作用下产生光信号，发光强度与被测物浓度成正相关[12]。对CLIA法及传统RIA法检测性能的对比研究已有大量报道，黄富亮和高通[13]比较分析了两种方法的准确性、精密度及线性范围的差异。CLIA法回收率(99.1%～102.3%)优于RIA法的回收率(94.2%～108.9%)，表明CLIA方法准确性更高；CLIA法的批间变异系数小于RIA法(P<0.01)，但批内变异系数大于RIA法(P<0.01)，表明CLIA法的精密度略差；两种方法检测的相关性良好(r=0.996，P<0.01)，CLIA法的线性范围(25～850 pg/mL)大于RIA法线性范围(22～700 pg/mL)。黄盼等[14]采用CLIA法检测血浆PRC，探讨了血浆醛固酮/肾素浓度比值在PA筛查中的诊断价值，为临床诊断PA提供了参考。文献指出采用CLIA法较传统RIA法具有灵敏度高、稳定、可重复性、容易操作等优点。CLIA法直接测定PRC，无需进行血浆孵育，自动化程度高，可进行批量检测，并且无放射性污染。与PRA检测相比，用该方法直接测定PRC更加简单易行，但考虑肾素浓度与肾素活性评价在临床诊断中的相关性，此方法目前在国内未广泛开展，仍有待于进行较全面的评价，为临床应用提供参考[12]。

4 挑战与展望

肾素在血浆中含量低，分子结构复杂，且临床中影响肾素检测的因素较多，如采样时间、采样体位等，因此肾素水平评价属于较复杂的检测项目。目前用于肾素水平评价的两种方法：PRA检测及PRC检测，在检测结果相关性方面，不少研究者对其准确性、精密度、线性范围、参考值范围等检测性能进行了对比，但是由于各实验室间样本地区、数量、实验室仪器等存在差异，各项目对比结果不尽相同。浓度检测结果虽不能完全优于活性检测，但是可自动化、不产生放射性污染等显著优势使其有望替代活性检测，用于临床高血压等相关疾病的诊断。目前国内已有北京、上海、广州等少量医院开展了肾素浓度评价。我国目前仍未开展肾素的全国内分泌室间质量评价(EQA)计划，缺少各检测系统内和系统间的基线数据。在临床各方面的推动下，国家卫生健康委员会临床检验中心同国家高血压专病医联体、高血压认证中心于2019年7月在桂林启动了肾素醛固酮标准化项目。此项目计划利用WHO国际标准品作为肾素溯源链的顶端，研制具有互通性的参考物质，开展肾素一致化计划，以期改进肾素的检测现状，实现肾素检测结果的互通可比性[15]。