脑胶质瘤的基因治疗与病毒治疗研究进展

2021-11-29张国栋鞠海涛黄平岳鹏万方窦长武

临床神经外科杂志 2021年2期

张国栋，鞠海涛，黄平，岳鹏，万方，窦长武

脑胶质瘤是一种起源于神经胶质细胞的肿瘤，占所有中枢神经系统肿瘤的40%～50%，约占所有中枢神经系统恶性肿瘤的80%，其发病率在全球范围内持续上升[1]。虽然近年来在脑胶质瘤的治疗上有了不少进展，如积极手术切除、放化疗或两者联合治疗[2]、抗血管生成治疗和分子靶向治疗等，但是患者的生存率仍然很低[3]，平均生存期只有14.6个月。脑胶质瘤易复发和长期生存率低的主要因素包括：(1)由于中枢神经系统内肿瘤的血-脑屏障，化疗药物的递送困难；(2)由于中枢神经系统受系统性免疫反应的影响小，限制了系统性免疫的杀伤效力；(3)由于胶质瘤肿瘤细胞沿血管和脑白质的具有高度侵袭性弥漫性生长，难以完全手术切除肿瘤；(4)由于肿瘤干细胞细胞群对肿瘤自我更新，对化疗和放疗耐药[4]。因此迫切需要研究新的治疗方式。目前越来越多关于脑胶质瘤新分子治疗方法的研究引起了关注，其中基因治疗、溶瘤病毒疗法和免疫治疗在早期临床研究中显示出极好的前景。现对基因治疗的递送载体、胶质瘤的治疗基因、常见的溶瘤病毒，以及溶瘤病毒携带治疗基因的组合疗法及其优点综述如下。

1 胶质瘤的治疗基因

胶质瘤不同类型基因治疗的临床试验证实基因治疗是安全的[5]。脑肿瘤一般局限于脑部，很少转移到其他组织；故可以直接针对胶质瘤中分裂的肿瘤细胞(大多数脑细胞是有丝分裂后期的)进行治疗，以此来抑制肿瘤的生长。胶质瘤的独特性使其成为基因治疗的目标。

1.1 条件细胞毒性基因有条件细胞毒性基因治疗的目标是将最初的非细胞毒性酶递送到肿瘤细胞中，然后没有毒性的前药通过相应的酶转化为细胞毒性代谢物。由于并非所有肿瘤细胞都能表达靶酶，因此其功效很大程度上取决于所谓的“旁观者效应”；其中毒性代谢物能够扩散并作用于周围的肿瘤细胞。该疗法可抑制血管生成并产生抗肿瘤作用[6]。

1.1.1 单纯疱疹病毒-胸苷激酶(herpes simplex virus-thymidine kinase,HSV-TK)/更昔洛韦(ganciclovir,GCV)系统 HSV-TK/GCV系统已在临床前和临床上进行了广泛的基因治疗研究[7]。在该系统中，GCV不能被哺乳动物的TK磷酸化，但是病毒的TK可以使其磷酸化。HSV-TK可将GCV转化为GCV的毒性磷酸化代谢产物，从而抑制S期细胞的DNA合成并引发细胞凋亡。虽然GCV三磷酸不能穿过细胞膜，但可以通过间隙连接分布并引起旁观者效应。在接受HSV-TK/GCV基因治疗的胶质母细胞瘤患者中也显示出抗肿瘤免疫反应[8]；与对照组相比，接受基因治疗的患者的白细胞介素(interleukin，IL)-12和干扰素-γ(interferon γ,INF-γ)水平显著升高，这与肿瘤细胞坏死后血液中释放的抗肿瘤抗原的免疫系统激活有关[8]。

1.1.2 CD/5-FC系统胞嘧啶脱氨酶/5-氟胞嘧啶(cytosine deaminase/5-fluorocytosine，CD/5-FC)是另一种有前景的酶/前药组合。当5-FC用作CD底物时，所得的5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)产物抑制胸苷酸合成酶，导致细胞死亡。由于5-FU可自由扩散到周围的肿瘤细胞中，基于CD的基因治疗能够引起肿瘤消退伴随强大的旁观者效应；并且已经在大鼠神经胶质瘤模型实验中显示出其效果[9]。

1.1.3 其他系统另一个系统是兔羧酸酯酶(rabbit carboxylesterase，rCE)/伊立替康系统。与人羧酸酯酶相比，rCE能更有效地将伊立替康转化为细胞毒性药物7-乙基-10-羟基喜树碱；后者是一种毒性更强的物质，能强烈抑制拓扑异构酶Ⅰ[10]。此外，还有脱氧胞苷激酶(deoxycytidine kinase，dCK)/阿糖胞苷(cytarabine Arabinoside，AraC)系统，dCK可将AraC转化为Ara-胞苷-5′-三磷酸，抑制DNA合成[11]。

1.2 靶向毒素在一些胶质瘤亚型中，肿瘤细胞上的特异性受体的过表达为胶质瘤的靶向治疗提供了极好的途径。这些特异性受体主要包括表皮生长因子受体Ⅲ型突变体(epidermal growth factor receptor variants Ⅲ，EGFRvⅢ)抗体、IL-13Rα2、尿激酶型纤溶酶原激活物(urokinase type plasminogen activator，uPA)、转铁蛋白和其他几种多肽。在靶向毒素方法中，靶受体的天然配体与细胞毒性细菌产物如假单胞菌(pseudomonas,PE)和白喉外毒素(diphtherotoxin,DT)的催化和易位结构域融合[12]。由于这些特异性受体在正常脑组织中几乎不存在，因此这是一种极具吸引力的治疗策略，而且其潜在的副作用很小。通过这种方式，在过表达靶向受体的肿瘤细胞中选择性地抑制蛋白质合成，而使正常的神经细胞免于细胞毒性作用。

1.3 靶向胶质瘤的转基因胶质瘤基因治疗的另一种策略是特异性靶向肿瘤发生，以阻止肿瘤的生长。新毛细血管的形成，是恶性肿瘤的标志性特征。其可以通过递送抗血管生成基因或通过降低促血管生成因子的表达来靶向治疗[13]。大量抗血管生成基因已被用于胶质瘤基因治疗，包括编码脑特异性血管生成抑制剂(brain specific angiogenesis inhibitors,BAI)、血管抑素、内皮抑素、血栓反应素、组织金属蛋白酶抑制剂(tissue inhibitor of metalloproteinase,TIMP)、C-X-C基序趋化因子配体4(C-X-C motif chemokine ligand 4,CXCL4)和IL-12。编码血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor,FGF)和IL-8的促血管生成基因都是基因治疗的潜在靶点。另外，通过编码DNA修复蛋白MGMT的失活以提高烷化剂替莫唑胺(temozolomide,TMZ)的治疗效果，也能达到治疗胶质瘤的作用。递送TP53肿瘤抑癌基因也被认为是一种可行的基因治疗方法。

1.4 免疫调节治疗基因免疫系统是一种强有力的内源性资源，可以抗肿瘤生长[14]。活性多克隆抗肿瘤免疫应答具有长期免疫记忆的潜力，并具有清除手术后残留的耐药和抗原丢失的肿瘤细胞的能力。众所周知，胶质瘤在抗肿瘤免疫治疗上存在许多特有的障碍，其中包括由于中枢神经系统的血-脑屏障(blood brain barrier,BBB)和缺乏经典抗原呈递细胞(antigen presenting cell,APC)限制了胶质瘤的免疫治疗；同时，胶质瘤微环境中的免疫抑制细胞因子和细胞亚群也抵消有效的抗肿瘤免疫反应。然而，这些并非绝对的障碍，在高级别胶质瘤(high grade gliomas，HGG)中增加BBB的通透性有利于淋巴细胞浸润。广泛的临床前研究证据表明，肿瘤的免疫抑制性微环境可被逆转以产生有效的抗肿瘤免疫应答[15]。IL-2、IL-12、IL-4、IFN-γ、IHF-α、β和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)都是细胞因子途径的免疫调节基因治疗的候选者[16]。另一方面，利用表达Fms样酪氨酸激酶3(Flt3)配体的ADV载体募集免疫细胞策略可将树突状细胞(dendritic cell,DC)和其他APC募集到脑肿瘤中。将此方法与提高胶质瘤抗原免疫原性的方法相结合，是产生有效抗肿瘤免疫应答的潜在策略。

2 胶质瘤溶瘤病毒治疗的常见病毒

溶瘤病毒分为具有复制能力的溶瘤病毒和复制缺陷型病毒载体。其特点是病毒特异性感染肿瘤细胞并通过释放病毒后代诱导肿瘤细胞溶解，还能激发免疫反应，吸引更多免疫细胞来继续杀死残余癌细胞，同时保留周围正常的脑组织；并且已经在早期临床试验中证实了其安全性。

2.1 单纯疱疹病毒1型(herpes simplex virus-1，HSV-1) 由于HSV-1天然的嗜神经性，首次报道经基因改造的HSV-1就是于胶质瘤溶瘤病毒研究中[17]。为了实现在肿瘤组织中保持有效的溶瘤活性，同时在正常组织中溶瘤活性最小化，已经研究了许多遗传修饰或缺失。如ICP6(由μl39基因编码)是非分裂细胞中DNA合成所需的病毒核糖核苷酸还原酶(ribonucleotide reductase，RNR)的大亚基，尽管其对于活跃分裂肿瘤细胞进行病毒复制不是必需的；然而μl39的缺失诱导HSV-1在活跃分裂细胞中高水平复制。另一方面，由HSV-1携带的34.5基因编码的蛋白是dsRNA依赖性蛋白激酶R(protein kinase R,PKR)途径的负调控因子，并且通过恢复真核起始因子2(eukaryotic initiation factor-2，eIF-2)(蛋白质合成中的重要因子)的活性使病毒在正常细胞中复制，否则就会被PKR所抑制。由于胶质瘤细胞中的组成型活性表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)，使γ34.5缺失的HSV-1能够克服功能缺陷并复制，但在正常细胞中不会复制[17]。除了这些特定的遗传修饰外，还包括其他一系列改进，如ICP47额外缺失逆转了主要组织相容性复合物(major histocompatibility complexes,MHC)Ⅰ类分子的抗原负载活性的抑制作用，导致溶瘤性HSV-1诱导肿瘤特异性的免疫应答反应[18]。

2.2 腺病毒最常见的腺病毒载体来自于人类腺病毒5型(human adenovirus 5,hAd5)。已知该病毒的纤维旋钮通过识别细胞表面的柯萨奇病毒和腺病毒受体从而决定其靶细胞。然而，由于胶质瘤细胞表面缺乏上述受体从而对hAd5感染具有抗性，这就限制了hAd5病毒载体的临床应用[17]。

溶瘤腺病毒Delta-24-RGD，是以腺病毒5型为基础进行改造的一种溶瘤腺病毒；由于其E1A区缺失24 bp碱基，可以在RB基因突变的肿瘤细胞内复制。有研究使用病毒的Fiber部分进行RGD(arginine-glycine-aspaarticacid，RGD)修饰，修饰后的病毒可以与细胞表面的整合素 (intergrin)αvβ3和αvβ5结合并相互作用使病毒进入细胞，提高了病毒的感染性。在一项Ⅰ期临床试验中，一次性将这种经过改造的腺病毒(Delta-24-RGD)直接注射到25例手术和其他治疗后胶质母细胞瘤复发患者的肿瘤中，结果显示20%的患者存活了3年或更长的时间[19]。这是溶瘤病毒诱导直接溶瘤效应和抗肿瘤免疫反应的第一个临床相关研究报道。

2.3 呼肠孤病毒呼肠孤病毒是一类无包膜的dsRNA病毒，可通过结合大量表达的唾液酸受体和结合粘附分子(adhesion molecule，AM)有效感染大多数人类细胞，而不会引起任何严重的并发症[20]。尽管呼肠孤病毒不具有细胞选择性，但由于丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶(mitogen activated protein kinase/extracellular signal regulated kinase，MAPK/ERK)信号通路通常在肿瘤中高度活化并抑制PKR功能，因此可以在包括神经胶质瘤在内的肿瘤细胞中选择性地复制。其肿瘤细胞限制性复制能力使呼肠孤病毒成为溶瘤病毒治疗中一种有希望的高效溶瘤病毒。此外，最近的研究表明呼肠孤病毒疗法联合常规分次放疗(fractionated radiotherapy,FRT)和化疗显示出协同作用[21]。

2.4 麻疹病毒(measles virus,MV) 麻疹病毒是一类具有包膜的ssRNA病毒，众所周知MV引起麻疹并且会导致脑炎[22]。MV的两种主要蛋白在脑胶质瘤治疗中具有较高溶瘤特异性。MV的趋向性是由血凝素(hemagglutinin，H)糖蛋白与宿主细胞受体(如连接蛋白-4和CD46)的亲和力决定的。H糖蛋白与CD46受体有高度亲和力，在胶质瘤等肿瘤细胞中大量表达；而F蛋白介导细胞与细胞的融合，诱导细胞凋亡。由于其致病性，具有癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)表达的高度减毒的麻疹病毒株-Edmonston菌株(MV-Edm)已在胶质瘤中显示出潜在的治疗效果。此外，已经开发出转基因MV，以重新靶向HGG中的表面肿瘤特异性抗原(tumor specific antigen,TSA)；如EGFR变异体Ⅲ(EGFRV Ⅲ)或高亲和力IL-13结合的跨膜蛋白IL-13受体2(IL-13R 2)[23]。

2.5 脊髓灰质炎病毒(poliovirus,PV) 脊髓灰质炎病毒是一类具有包膜的ssRNA病毒，是引起脊髓灰质炎的高度特异性人类病原体。由于其对CD155[也称为脊髓灰质炎病毒受体(poliovirus receptor,PVR)或nectin样分子-5(Necl-5)]的结合亲和力引起的嗜神经性，已被用于治疗HGG。此外，在翻译水平上进行基因改造,即将PV基因组中的内部核糖体进入位点(IRES)序列替换为人类鼻病毒2型(human rhinovirus 2，HRV2)增强了肿瘤特异性,并使PV的致病性最小化。研究显示该嵌合PV严格地复制并且在胶质瘤细胞中具有溶瘤作用，通过删除编码衣壳蛋白的基因改造PV复制子，使得病毒仅经历单个裂解循环[24]。这种非致病性的病毒复制在体内外胶质瘤细胞中都显示出了溶瘤活性。

2.6 其他病毒新城疫病毒(newcastle disease virus,NDV)是一种已被证实在大多数禽类中具有高致病性的ssRNA病毒，但通常仅在人类中引起轻度喉炎和结膜炎。虽然NDV的特异性溶瘤作用已被研究证明，但其相应的机制尚不清楚。痘苗病毒(vaccinia virus，VV)是一种大型的、具有包膜的双链DNA病毒[24]，其在作为天花疫苗使用中已被证明减毒VV是安全的。虽然VV主要用于基因治疗和免疫治疗，但有许多研究表明其具有较好的肿瘤选择性溶瘤活性，并且在一项Ⅰ期临床试验中证明了其安全性[25]。

3 携带治疗基因的溶瘤病毒的组合疗法

许多学者进行了上述溶瘤病毒和治疗基因的组合疗法研究。与传统病毒治疗相比，其优点不仅体现在溶瘤病毒在肿瘤细胞内复制并且破坏肿瘤细胞的传递作用，同时也体现在病毒载体中包含的治疗基因的杀伤作用。溶瘤性HSV-1携带治疗性转基因，如TNF-α、VEGF的短发夹RNA结构或IL-4，已用于组合性胶质瘤治疗。此外，对溶瘤AdV经基因改造以表达IFN-γ、双自杀基因CD/5-FC和HSV-TK/GCV或IL-12，在临床前和临床研究中均被证明有效；更重要的是，大量的证据表明使用复制缺陷型病毒载体或携带治疗基因的溶瘤病毒治疗胶质瘤没有明显的毒性[26]。因此，临床可以尝试利用多种治疗特点的新病毒平台或通过编码病毒载体中的强效基因，通过多种不同治疗效果的组合疗法来提高胶质瘤的疗效。

4 基因治疗和病毒疗法的潜在优势

胶质瘤的基因治疗和病毒疗法的潜在优势已经从多项临床前和临床研究的结果中得到证实[17-18,25]。首先，与常规治疗方式不同，基因治疗和病毒疗法旨在以高度特异性的方式根除胶质瘤。递送至肿瘤细胞的基因在异常信号传导时被激活或发挥其特异性毒性；类似地，溶瘤病毒具有天然嗜神经性或通过遗传修饰来影响胶质瘤细胞，但不作用于正常细胞，病毒复制及其溶瘤作用仅限于活跃的增殖细胞[25]，所有这些因素都提供了极强的治疗效应。其次，有多项胶质瘤基因治疗和溶瘤病毒疗法研究的Ⅰ期和Ⅱ期临床试验结果显示，基因治疗和溶瘤病毒疗法具有非常有效的肿瘤细胞杀伤能力和较高的安全性。虽然其临床效果仍存在一些局限性，但通过深入研究探讨一定会解决这些难题。此外，将纳米颗粒引入临床神经肿瘤治疗可进一步提高基因治疗和病毒疗法在胶质瘤治疗中的潜在作用[27]。最后，正如许多研究表明的，基因治疗可能与传统的治疗方法(如手术切除及放化疗)有协同作用。