化学遗传学技术在癫痫治疗中的探索与展望

晏僖，杨小枫

癫痫是脑部神经元高度同步化异常放电引起的慢性疾病。目前癫痫的患病率为1%，其中30%的患者为药物难治性癫痫，部分药物难治性癫痫患者可以选择手术治疗，但仍有相当部分的患者手术疗效不佳或缺乏手术适应证[1]；因此，不断出现新的治疗方法[2]。近年来精准医疗已经成为现代医学发展的趋势。过去二十年，光遗传学及化学遗传学因为能够特异性地调节神经元的兴奋性，已经被引入到癫痫治疗的研究之中。另外，不依赖光照装置植入的非侵袭性的优点，使得化学遗传学技术在临床转化上更具有前景[3]。化学遗传学是一种通过改造生物大分子物质，使其能与先前无法识别的小分子化学激动剂相互作用的方法[4]。目前已成功改造的大分子包括：蛋白质激酶、代谢酶、配体门控性离子通道和G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors，GPCRs)等[2]。基于GPCRs改造的，只由特定药物激活的受体(designer receptors exclusively activated by designer drugs，DREADDs)技术是目前应用最广泛的化学遗传学技术。现对DREADDs技术的机制及其在癫痫治疗中的研究现状综述如下，并对该技术今后的临床转化进行展望。

1 DREADDs技术

2007年，Roth和Armbruster等首次报道了DREADDs技术。其团队通过对酵母的人毒蕈碱型乙酰胆碱受体M3亚型(human M3 muscarinic receptor,hM3)进行数轮随机诱导突变并进行筛选，从而得到不能与乙酰胆碱结合的受体。但这一受体可与纳摩尔浓度级别的氯氮平的氮氧化物(clozapine-N-oxide,CNO)结合。该受体具有Y3.33C和A5.46G两个氨基酸位点突变。CNO作用于该受体后激活类似乙酰胆碱作用于M3受体的Gq信号通路，使细胞内Ca2+浓度增加，在成熟神经元中产生去极化，引起细胞兴奋性增加，因此被命名为hM3Dq[5]。选择CNO作为该突变受体的化学激动剂进行筛选，是考虑到CNO的母体化合物氯氮平具有与M3受体的高亲和性、良好的血-脑屏障穿透性、药代动力学特性，以及CNO在生理条件下的药理学惰性。这些优点使其成为理想的DREADDs配体[6]。由于Y3.33和A5.46在不同的人毒蕈碱受体亚型中的保守性，该团队陆续研发出一系列基于毒蕈碱受体的DREADDs家族成员(hM1Dq、hM2Di、hM3Dq、hM4Di和hM5Dq)[5]。其中hM1Dq、hM3Dq和hM5Dq可与Gq蛋白α亚单位(Gq protein α subnit，Gαq)结合，激活Gq信号通路，调动细胞内Ca2+，引起细胞兴奋性增高；其中hM3Dq常作为增强神经细胞放电的有力工具[7]。hM2Di和hM4Di与Gi受体(对腺苷酸环化酶有抑制作用的受体)结合，激活Gi信号通路，引起G蛋白内向整流性钾离子通道(G-protein inwardly rectifying potassium channels,GIRKs)开放，引起细胞超极化，减少神经细胞自发性放电活动[5]。因此hM4Di在非侵袭性的静默神经细胞的离体或在体实验中被广泛使用[8]。为进一步扩展DREADDs库，Guettier等研发了选择性激活Gs信号通路的Gs-DREADDs，从而激活cAMP介导的信号通路，引起细胞兴奋性增高。但与hM3Dq及hM4Di不同的是，Gs-DREADDs能够在一些细胞中表现出一定的活性，这限制了该受体的广泛使用[9]。2012年，基于β-arrestin的DREADDs技术也被报道。该受体可以在体外激活β-arrestin通路，但是该受体完全激活依赖高浓度的CNO，从而影响该受体的使用[10]。

将DREADDs转染到特异类型的细胞上需要借助慢病毒、腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)或改良的单纯疱疹病毒(modified herpes simplex viruses,HSVs)等病毒载体。目前最常使用的主要有三种方法：(1)借助组织特异性启动子携带DREADDs基因通过病毒载体，使DREADDs表达在特定位置特异类型的细胞上[9]；(2)借助Cre-LoxP重组酶系统的特异性，通过注射携带DREADDs基因的FLEX开关(反向双开放读码框，double-inverted open reading frame,DIO)的病毒载体转染到Cre转基因小鼠脑内，使DREADDs只表达在Cre表达的细胞上[11]；(3)利用改造的单纯疱疹病毒的投向特异性，从而联合使用表达Cre重组酶的逆向示踪狂犬腺病毒(canine adenovirus,CAV)，即CAV-Cre和带有FLEX-DREADDs的AAV(如AAV-FLEX-hM3Dq)。由于CAV的逆向投射作用，位于轴突投射区的CAV-Cre能够逆行到转染了FLEX-DREADDs病毒的神经元胞体，通过Cre-LoxP重组酶系统的特异性，DREADDs只表达在发出该投射的神经元细胞膜上[12]。该逆向示踪功能使其成为神经环路研究的有力工具，使得精准调控目标脑区特定投射的神经元成为可能。

CNO是DREADDs 经典的化学激动剂，是非典型抗精神病药物氯氮平的药源性惰性代谢产物。许多实验证实，CNO在推荐剂量(0.1～0.3 mg/kg)下在小鼠或大鼠体内具有惰性，并不出现药理学和行为学的影响[13]。但有实验表明CNO在体内可以转化成氯氮平[14]；而氯氮平对DREADDs受体具有更强的亲和力和作用效果[15]。低阈值浓度的氯氮平(0.1 mg/kg)可以产生与10 mg/kg CNO相同的作用效果[15]。氯氮平是已经被FDA批准的临床用药，主要用于抗精神病的治疗，具有明确的药代动力学和药效动力学特性以及已知的不良反应，并且其选择性激活DREADDs受体所需要的浓度非常低。Weston团队研究发现低剂量浓度的奥氮平(一种抗精神病药物)也可以作用于hM4Di受体[16]。这些发现使DREADDs技术的临床转化更具有前景。

2 DREADDs技术在癫痫治疗中的研究

2005年Boyden团队首次报道了光遗传学技术可将光敏感性蛋白表达在特定的细胞上，利用特定波长的光线激活，从而实现对神经活动毫秒级别的精细调控[17]。化学遗传学技术具有与光遗传相似的细胞选择性的调控神经元兴奋性的功能，同时又比光遗传学技术有一些明显优势，使之更利于临床转化。这些优势为：(1)化学遗传学技术不需要植入光纤，因此不会对脑组织造成损伤，亦不会引起光毒性；(2)由于化学遗传学技术可以经过系统给受体激动剂，故可以对于多个致痫灶以及大面积的致痫灶进行控制；(3)相比光遗传学技术对装置的依赖，化学遗传学技术使用的CNO具有生物亲和性，其多种给药途径(如静脉注射、口服、腹腔注射)使得DREADDs技术更加简便可行；(4)相较于光遗传学对神经活动毫秒级别的控制，化学遗传学能够产生长时程的兴奋或抑制，更加有利于癫痫的治疗[3]。

2014年，Kätzel等[18]首次报道了DRADDs技术可用于癫痫治疗研究。该实验采用匹鲁卡品和苦味素大鼠急性皮层癫痫模型及破伤风毒素的慢性皮层癫痫模型，用载有hM4D(Gi)的AAV，通过CaMKⅡa启动子将该受体特异性地表达在运动皮层第5层的锥体细胞上。结果显示，1 mg/kg的CNO经腹腔注射后可以明显降低癫痫的发作频率和能量，缓解癫痫发作的严重程度。同时该实验组使用膜片钳技术实验发现，将CNO作用于转染了hM4Di的海马脑片上能可逆性地抑制突触兴奋性神经递质的释放。这提示化学遗传学技术可能会成为控制皮层癫痫发作的新方法。2016年Avaliani等报道了CNO作用于表达hM4Di的海马脑片上可引起细胞超极化，抑制癫痫样放电[19]。Akerman等[20]用Cre-LoxP重组酶系统的特异性离体脑片和在体癫痫模型研究表明，海马中间神经元这一抑制系统的激活可以在原位抑制癫痫样同步化放电。2018年，Darwin等[21]研究报道，海马神经干细胞移植能够减少颞叶癫痫的慢性发作；同时，用化学遗传学技术选择性地将分化成的中间神经元抑制后，痫样放电增加；从而表明神经干细胞移植是治疗颞叶癫痫非常有前景的方法。这些结果证明了用化学遗传学技术通过抑制癫痫起始区的锥体神经元或激活中间神经元，可以抑制痫性放电，从而达到控制癫痫发作的效果。

Wicker等[13]使用杏仁核点燃的颞叶癫痫模型，用携带hM4D(Gi)基因的AAV，通过hsyn启动子将该受体表达在丘脑中缝核群和板内核群的神经元(包括兴奋性神经元和抑制性神经元)上；结果显示CNO可以明显抑制癫痫的脑电和行为学发作。陈忠实验组[22]在Vgat-Cre转基因小鼠的海马下托(subiculum)注射载有hM3Dq的AAV，借助Cre-LoxP重组酶系统的特异性，将该受体特异性地表达在海马下托的中间神经元上。实验结果显示，海人酸诱导的急性颞叶癫痫模型注射CNO后可以减轻癫痫发作的严重程度，延长癫痫发作的潜伏期，并减少全面性发作的次数。进一步地，该团队利用光遗传学和化学遗传学技术选择性抑制海马下托锥体神经元的兴奋性，从而逆转了苯妥英钠耐药性颞叶癫痫，而将锥体神经元选择性激活则直接诱导耐药形成；这表明了海马下托锥体神经元对于颞叶癫痫耐药的形成具有重要的“门控”作用[23]。Berglind等于2018年报道了将hM4Di受体表达在对侧的海马，能够减弱同侧海马的后放电，证明了对侧海马在颞叶癫痫进展中的重要作用[24]。Suh研究发现，用CNO特异性地作用于海马齿状回新生颗粒细胞的hM4Di可以明显地降低匹鲁卡品诱导的慢性颞叶癫痫的痫性放电和自发性癫痫发作；并且用CNO特异性地作用于海马齿状回新生颗粒细胞的hM3Dq受体，能够显著地增加匹鲁卡品诱导的慢性颞叶癫痫的痫性放电和自发性癫痫发作[25]；表明海马齿状回新生的颗粒细胞对痫性环路的形成起着重要的作用，是癫痫治疗的潜在靶点。以上研究结果提示化学遗传学技术可以通过抑制痫性环路中某一靶点的兴奋性，在癫痫传播过程中控制颞叶癫痫的发作；同时表明丘脑中缝核群、海马下托、对侧海马，以及在癫痫持续状态后海马齿状回新生的颗粒细胞是有效控制颞叶癫痫发作的靶点。

综上所述，尽管DREADDs技术在癫痫治疗领域中的探索仍处于初步阶段，但已有的离体组织及癫痫动物模型实验结果表明该技术都能有效地控制癫痫活动。

3 DREADDs技术在癫痫治疗的展望

3.1 癫痫起始和传播过程中局部和远程的调控 目前癫痫的治疗可以大致分为两种策略：(1)直接地或通过局部环路调控癫痫起始区的兴奋性；(2)通过对丘脑-皮层-基底节网络中某些靶点的远程调控，影响癫痫在这些通路上的传播[26]。基于同样治疗策略的脑深部刺激(deep brain stimulation,DBS)已经在临床癫痫治疗应用中有着较长的历史[27]。

癫痫的起始和传播与脑网络形成的环路密切相关。如海马-乳头体-丘脑前核-扣带回-海马的Papez环路与颞叶癫痫的起始与扩散有关[28]，而皮质-丘脑-皮质环路与失神癫痫关系密切[29]。目前的研究已经证明这些环路中的海马[30]、丘脑前核[31]，以及小脑的抑制性传出通路浦肯野纤维[32]是癫痫治疗的有效靶点。因此调节神经环路结点的兴奋性对于控制癫痫的起始和传播具有重要的作用；而发现能够控制各种类型癫痫发作的关键节点，对有多个致痫灶而不能进行手术的患者，以及致痫灶位于功能区的药物难治性癫痫患者均具有非常重要的意义。

3.2 锥体神经元和中间神经元兴奋性选择性的调节 尽管癫痫产生的机制尚不完全清楚，但是其与神经元兴奋性和抑制性的不平衡是密切相关的，这一理念被普遍认可[33]。已有许多证据表明兴奋性的锥体神经元与抑制性的中间神经元的相互作用对癫痫的产生具有重要意义。离体大鼠海马脑片锥体神经元和中间神经元的同步性全细胞记录显示，在癫痫发生的不同时期这两种类型的神经元激活的时间不同；中间神经元在癫痫起始时更加活跃然后出现去极化阻滞，此时锥体神经元放电增加[34]。Huberfeld等[35]研究显示，癫痫患者的海马组织中锥体神经元活动增加是将会出现癫痫发作，而随着中间神经元活性增强则癫痫发作逐渐停止。而DREADDs技术能够特异地改变不同种类神经元的兴奋性，这一特点使其成为可对癫痫进行精准治疗的又一新方法。DREADDs技术可以精准地调控癫痫起始区或致痫网络重要节点特异类型细胞的兴奋性。从离体组织到在体实验，应用DREADDs技术控制不同癫痫模型(不同机制的致痫剂或脑卒中所导致的急、慢性局灶性皮层癫痫和颞叶癫痫模型)的研究结果显示，其是一种有前景、可对癫痫进行精准调控的新型治疗方法。目前DREADDs已经可以在非人灵长类动物的细胞上成功表达，能够调节神经电生理学特性，并出现行为学改变，且未出现毒副作用[36]。因此，化学遗传学技术在癫痫治疗领域的临床转化有非常好的前景。

4 DREADDs技术在癫痫治疗领域中面临的挑战

虽然DREADDs技术在癫痫治疗中的实验研究具有一定的效果，但是将DREADDs转染到人类细胞上还需要考虑病毒载体的安全性。目前在人体的基因治疗中使用AAV已有先例，且其长期的表达并未出现明显的副作用[37]。因此，尽管还需要更加长时间的临床观察，但AAV是最有可能实现临床转化的病毒载体。与此同时，在难治性癫痫的精准治疗中，其他方法的基因治疗的临床试验，如将电压门控性钾离子通道—Kv1.1通过病毒转染到脑组织，从而降低神经元的兴奋性，进而治疗难治性癫痫，也在进行中[38]。探测新的基因治疗的安全性、耐受性的研究将为癫痫的精准治疗带来新的曙光。

综上所述，DREADDs技术能够持久地调节GPCRs的信号通路，并具有诱导神经调控的生理相关性、非侵袭性、可逆性等优点，在癫痫治疗临床转化中有十分光明的前景。