超声波靶向微泡击碎技术在心脏病基因治疗中的现状与前景

黄叶，陈巍综述 田海审校

近年来，心脏病在全球疾病死亡原因构成比中一直居高不下。随着基因工程和分子生物学的不断发展，研究者发现基因治疗可以通过调节基因表达，针对疾病特异性靶点，选择性地延缓或阻断疾病的发展过程。在心脏病中，基因治疗通过抗氧化应激、抗间质重构和增加局部组织血运等多种机制显著改善心功能。但基因转染的方式尚需不断开拓。超声波靶向微泡击碎技术(ultrasound targeted microbubble destruction，UTMD)凭借其无创、靶向性强、免疫原性低、毒性低和可重复性等优点，成为临床前基因转染的重要方式，有着巨大的发展潜力和临床转化的可能性，在心脏病基因治疗中的应用值得深入探讨。

1 心血管疾病与基因治疗

在20世纪60年代，基因治疗的概念被最先提出，随着重组DNA技术与基因转染技术的突破，基因治疗从概念走向技术实施。2017年美国政府批准CAR-T疗法及yescarta基因疗法治疗淋巴瘤患者，标志着基因治疗在伦理与法治上得到允许，正式成为可应用于临床的治疗方式。基因治疗在多领域难治疾病方面拥有巨大潜力，在心血管疾病中，基因治疗可通过抗氧化应激、抗间质重构和增加局部组织血运等多种机制显著改善心功能。目前，基因治疗在体外研究中取得了较明显的成效，但由于转染方式的局限，体内研究往往达不到预期的效果[1-2]。目前常用的质粒和病毒载体均存在明显不足，如转染效率低和免疫原性等，使其难以在体内应用。因此，设计一种安全、高效的基因转染方式成为心血管疾病基因治疗研究中需要解决的关键问题[1]。高效、安全、靶向、可重复的UTMD应运而生，为介导体内基因转染提供了新的方法。

2 UTMD的主要作用机制

UTMD是在特定组织以一定频率和机械指数的超声使载有目的基因的微泡破碎以增强基因转染效率的技术，具有高效、安全、靶向的特点。超声微泡是由蛋白质、脂类或高分子聚合物等制成的外壳包裹惰性气体空化核构成，最早作为造影剂用于声学诊断，具有比普通超声更高的分辨率和对比度，尤其在心肌活性造影方面有着突出贡献。随基因转染方式的不断开拓，研究者发现超声微泡具有不易透过组织间隙、无肝肾毒性、在血液中稳定存在的优势，具有良好的生物安全性，将其与低压爆破模式的超声相结合，可以产生生物学效应以增强基因或药物的递送效率，UTMD技术由此产生[2]。其作用机制主要有：(1)空化效应，指液体中的微小空化核在超声波作用下被激发，经历振荡、塌陷、膨胀和收缩的一系列动态过程，分为惯性空化和稳定空化。其中惯性空化对细胞产生强烈的冲击和热效应，破坏血管内皮的完整性，使大分子通过内皮细胞间隙转移。稳定空化可刺激细胞的内吞作用，以增强细胞内的传递。注射微泡后血液中空化核浓度增加，可能降低空化阈值，最终增强超声空化效应[2-3]。(2)声孔效应，指细胞膜在超声作用下形成暂时性小孔的现象，大约持续24 h，可促进细胞对物质的摄取，与惯性空化有关，被认为是提高基因转染效率的主要机制。(3)微声流，是微泡剧烈破裂时产生的冲击波，作为驱动力量，促使基因通过破裂的微血管和内皮细胞间隙进入靶细胞[4-5]。此外，有研究提出了微泡破裂导致过氧化氢生成，引起细胞膜Ca2+内流和Ca2+依赖性K+通道开放，激发局部膜电位超极化，促进外源基因通过胞吞和胞饮作用进入细胞[6]。以上机制通过使血管内皮细胞连接疏松，细胞膜通透性增高和促进胞吞胞饮等促进外源基因进入靶组织，相互协同地提高基因转染的效率。

3 UTMD研究新进展

UTMD技术近年有显著的发展，不断更新换代。在微泡的基础上，有研究证实[7-8]，阳离子微泡可通过静电作用增强其基因携带能力，细胞膜和DNA同样带有负电荷，产生相互排斥的力量削减了DNA转染的效率,而携带阳离子的微泡可以更多结合带负电荷的DNA，一定程度上克服了两者间的斥力，更大程度增加了基因转染效率。张东旸等[8]运用UTMD技术通过阳离子微泡实现向大鼠缺血再灌注损伤心肌细胞靶向转染AKT基因，在短时间内基因在体内复制，并证实与传统微泡(DMB)相比，将AKT与阳离子微泡一起投递可以获得更高的转染效率和更优的心脏功能改善。Du[9]等利用UTMD和阳离子微泡将GDF11基因分别靶向转染到衰老小鼠、I/R小鼠和心肌梗死小鼠的心脏，使GDF11有效且选择性在心肌组织中过表达，降低了衰老标志物p16和p53，以及衰老小鼠心脏中p16+细胞的数量，使 Sca-1+细胞的增殖增加，证实通过UTMD重复靶向传递GDF11基因可促进衰老心脏的修复和损伤后组织再生，验证了UTMD结合阳离子微泡作为基因转染方式是安全有效的。

近年来随着UTMD的应用范围日益广泛，有研究发现，UTMD与其他技术结合可以发挥更大的基因转染作用。(1)UTMD与脂质体的结合发挥更强大的基因转染作用[10]。张明等[11]发现，纳米脂质体包载生物大分子药物FGF1结合UTMD技术可实现 FGF1的心肌靶向递送，通过抑制心肌氧化应激损伤的途径，改善糖尿病引起的心肌病理改变及心功能。主要原因与空化作用促进外源DNA从包涵体中释放，空化作用抑制胞吐作用有关[12]。(2)与外泌体联用减轻心肌细胞对外泌体的耐药性，增强外泌体在心肌组织中浸润，提高基因转染效率[13]。(3)MBs与单克隆抗体耦联提高其对组织器官的靶向性[14]。(4)结合核定位信号肽、AVV病毒载体提高转染效率， 延长外源基因表达时间，加强表达的稳定性[15-17]。

4 UTMD在心脏病中的实验研究

4.1 UTMD在细胞中的应用 UTMD介导基因转染治疗心脏病的靶组织主要是心肌和血管内皮。有研究通过UTMD向缺氧的大鼠心肌细胞(H9C2)转染shPHD2基因，结果表明UTMD能明显增强外源基因在心肌细胞中的表达水平，而对细胞活性并无明显影响[18]。Cao等[19]用UTMD方法向人脐静脉内皮细胞(HUVECs)转染miR-126-3p基因，结果证实UTMD能明显增强外源基因在血管内皮细胞中的表达，促进了血管内皮生长因子(VEGF)的合成和分泌，增强了内皮细胞生成血管的潜能。

4.2 UTMD在小动物模型中的应用 UTMD技术的安全性和有效性在小动物体内得到反复验证，已被证明在临床前评估中是可行的，以心肌梗死大鼠为动物模型的基因转染已经相当成熟。在大鼠体内，先前的研究通过UTMD实现了shRNA介导PHD2、S100A6、MMP2、TATp、SDF-10a等基因的转染，保护心脏免受急性心肌梗死的损伤[18，20-24]。Zhang等[18]应用UTMD转染shPHD2质粒抑制HIF-1α的降解并增加了其下游血管生成因子VEGF和bFGF的水平，使心肌梗死大鼠心脏血管生成和收缩能力得到显著改善。此外，缺血再灌注损伤是心力衰竭主要危险因素之一，有研究[22]利用UTMD向缺血再灌注损伤的大鼠心脏转染MMP2和Akt1，缓解心肌损伤和心室不良重塑，在基因治疗的角度为解决临床上心肌梗死患者远期预后不良提供了策略。也有研究向心肌梗死的兔心脏转染CD151和Ang-1促进梗死区域新生血管生成，达到治疗目的[25-26]。

UTMD在其他心血管疾病方面也有着突出贡献。Kopechek等[27]发现，UTMD介导antimiR-23a传递可抑制小鼠高血压性心肌肥厚，保护心肌收缩功能，这提示可有针对性的制定临床策略来调节人类心脏中的miRNA活性从而达到治疗的目的，为将来的临床转化研究奠定了基础。Huang等[28]发现通过UTMD向自发性高血压大鼠体内转染siGRK4可以降低其肾脏GRK4表达，从而作用于肾素—血管紧张素—醛固酮系统使血压下降。此外，UTMD在阿霉素心肌病、糖尿病性心肌病、化疗相关心脏毒性及心脏移植急性排斥反应等疾病的基因研究中也起着突出作用[29-32]。王卓等[33]首次使用UTMD技术转染siGal-7，选择性地抑制介导急性排斥反应的半乳糖凝集素-7的合成和分泌，使移植心脏的淋巴细胞浸润和坏死明显减少，并将免疫抑制作用局限于心肌，避免了激素及多克隆抗体带来的感染风险和其他全身不良反应。

4.3 UTMD在大动物模型中的应用 UTMD在大动物应用上还处于探索阶段。大动物比小动物模型心肌壁相对较厚，冠状动脉解剖清晰，精准结扎目标动脉，对转染后梗死区域变化评估更加精准。在以中大型犬为实验动物的研究中，利用UTMD引起心肌梗死犬心肌微环境改变，而心肌微环境对干细胞的存活、迁移和分化起着决定性作用，UTMD导致的轻度炎性反应改变和心肌损伤使MSCs移植效率及对心肌梗死的治疗作用明显增强[34-35]。有实验分别利用1 MHZ、1.0 W/cm2和300 KHZ、2.0 W/cm2UTMD将HGF、Ang-1基因转染至心肌梗死犬心脏中促进新生血管生成，减少心室重构和梗死面积，达到改善心功能的目的，不但用结合核定位信号肽和冠状动脉注射的方式提高了单纯静脉注射的效率，并且在参数选择上有了更深入的探索[36-38]。由于猪的组织与人的解剖结构十分相似，以猪为动物模型的研究有着近乎临床应用价值，但目前此类研究较少。早期有研究将UTMD用于改变心肌梗死猪的心肌微环境促进骨髓间充质干细胞(BMSCS)在心肌梗死区域的归巢，近年来也用于基因直接转染[39]。Schlegel等[16]向猪前室间静脉注入AVV6-Luc MBs，在1.3 MHZ、机械指数1.6的超声下靶向转染荧光素酶基因，增加了外源基因在特定心脏部位的表达，并且短期内未发现心肌损伤。冠状动脉微栓塞是PCI后重要并发症，其诱导的心肌炎性反应是心功能障碍的主要原因。有学者建立了猪的冠状动脉微栓塞模型，用UTMD靶向转染microRNA-21到心脏，通过抑制PDCD4/NF-κB/TNF-α通路抑制心肌炎性反应，改善心脏功能，并进一步探索了超声参数，认为2.0 W/cm2的脉冲强度在猪的心脏应用是适宜的[39-40]。可见，尽管UTMD作为一种新的基因转染方式已被广泛证实，但目前的研究大多是基于小动物模型。为更好的临床转化，需要进行更多的大型动物研究进一步评估其可行性和安全性。

5 UTMD在心脏病中的临床研究

目前，UTMD在心脏病基因治疗方面还未有应用于临床的报道，但在心脏病超声诊断中的应用十分广泛。超声微泡是良好的造影剂，与红细胞相似的直径使其既可以通过肺部毛细血管不被破坏，也不会被肾小球滤过，在血液中性质稳定。当微泡在特定的器官系统中循环，超声波可以引起微泡内气体显著的振荡和压缩，这种变化产生的谐波回声，使血池和心内膜的轮廓清晰，在体内产生增强的超声造影。普通超声对于评估肥胖、肺气肿和胸壁畸形患者往往显影不良，而超声微泡检查在心功能诊断中具有更高的敏感度和准确度[41]。皮淑芳等[42]报道1例因肥胖导致透声条件差的心力衰竭患者，采用超声微泡检查清晰地显示心肌致密化不全，左心室侧壁及心尖部肌小梁粗大，深陷隐窝内可见微泡填充，致密层和非致密层分界清楚，诊断为心肌致密化不全心肌病，为患者避免了危险性高的心肌活检和误诊的可能。Larsson等[43]分别用普通超声和超声微泡检查患者左心室射血分数和左心室容积，在普通超声检查中，不同超声医师之间得出的结果存在显著差异，而采用超声微泡检查，这种差异性明显降低，提示超声微泡检查减少了超声医师主观偏倚造成的结果差异。

此外，超声微泡在心肌微灌注造影和血栓诊治方面亦有突出贡献。超声微泡不但能够清晰地显示心腔结构，而且能够床旁检查并且实时观察心肌微循环灌注，对于相关疾病的确诊具有重要意义，尤其在超声微泡在评估冠状动脉血流方面，具有及时性和实时性等优点[44]。Senior等[45]比较了516例冠心病患者的超声微泡检查和单光子发射断层扫描，发现超声微泡检查具有更高的敏感度。血栓对人体有严重危害，溶栓和抗凝药物亦有极大的临床风险。一定强度的超声辐照产生的空化效应可使血栓软化甚至溶解，也有研究在靶向微泡中包裹溶栓药物，定向爆破微泡释放药物可增加溶栓效果，提升心肌灌注、改善心功能。综上，UTMD在心脏病超声诊断中的应用效果较好，给基因转染和药物递送的临床研究奠定了一定基础。

6 问题与展望

越来越多的临床前研究证实UTMD具有低免疫原性、无创、靶向性、实用潜力大等优点，肯定了其在治疗心血管疾病方面的潜在价值。然而，UTMD在临床应用前的技术改进仍需进一步研究：(1)超声靶向微泡击碎技术最佳参数目前国内外尚无统一标准，针对不同组织、不同基因及不同疾病的单独优化方案需要进行更多的实用性研究；(2)缺乏较长期的随访，无法对远期治疗效果和基因的长期表达进行评估；(3)缺乏在大动物模型中应用的研究，是临床转化的最大阻碍之一；(4)UTMD应用于临床的安全性尚需进一步研究和论证。可见，尽管许多研究肯定了UTMD的实用价值，但目前这项技术仍需不断完善。

综上所述，UTMD有很强的潜力用于心脏病基因治疗，但是未来研究会面临诸多挑战。随着研究的深入和技术的进步，更多治疗基因位点被发掘，疾病谱和基因数据库不断完善，相信这项技术会朝着更加个体化、高效、安全和靶向性强的方向不断发展，成为临床上心血管疾病基因治疗的理想途径。