基于网络药理学探究麻黄附子细辛汤治疗哮喘的分子作用机制

加梦还 张彩荣 冯龙飞

1.宜春学院化学与生物工程学院，江西宜春 336000；2.南京中医药大学附属南京中医院针灸科，江苏南京 210000；3.宜春学院美容医学院，江西宜春 336000

哮喘是呼吸系统常见的慢性疾病，以喘息、胸闷、咳嗽、呼吸短促等症状为主要临床表现，其病因复杂，涉及遗传、环境等多种因素[1]。当前，哮喘的药物治疗主要使用支气管扩张剂和糖皮质激素，感染期合并应用抗生素，虽取得一定的效果，病情暂时得到控制，但远期效果不甚理想。麻黄附子细辛汤出自《注解伤寒论》，麻黄、附子、细辛可化痰宣肺、止咳平喘，现代临床研究表明，麻黄附子细辛汤治疗哮喘具有显著效果[2]。为进一步明确麻黄附子细辛汤对哮喘的具体作用机制，本研究运用网络药理学方法，整合多项药物与疾病数据库，以期为临床研究提供新思路。

1 资料与方法

1.1 资料来源

本研究使用的数据库及软件有：通用蛋白质数据库（www.uniprot.org）、毒性与基因比较数据库（ctdbase.org）、中药系统药理学数据库与分析平台（tcmspw.com）、STRING 数据库（string-db.org）、网络图形拓扑分析与编辑软件（Cytoscape3.7.2）、人类基因组注释数据库(david.ncifcrf.gov)、微生信分析平台（www.bioinformatics.com.cn）、Venny2.1.0（bioinfogp.cnb.csic.es）。

1.2 麻黄附子细辛汤中活性成分及靶点的筛选

通过中药系统药理学数据库与分析平台检索中药麻黄、附子、细辛，以口服生物利用度≥30%，类药性≥0.18 为条件，筛选其中的活性成分并获取相关靶点。

1.3 疾病靶基因的筛选

在毒性与基因比较数据库中，通过关键词“Asthma”筛选出哮喘相关靶基因。

1.4 麻黄附子细辛汤靶基因的筛选

将“1.2”中药物靶点录入Uniprot 数据库中，进行基因标准化处理。

1.5 麻黄附子细辛汤治疗哮喘靶点

将药物活性成分靶点与疾病靶点通过维恩图取交集，从而初步获取麻黄附子细辛汤作用于哮喘的治疗靶点。

1.6 麻黄附子细辛汤-哮喘关键靶点的筛选及蛋白质-蛋白质相互作用（proteinprotein interaction，PPI）网络构建

将上述得到的交集靶点导入String 数据库，利用Cytoscape 3.7.2 计算进行网络拓扑属性分析，构建PPI网络图。

1.7 KEGG 通路富集和GO 生物过程分析

将上述关键靶点导入DAVID 数据库中，以FDR＜0.01 为筛选条件，其结果分别以条形图和气泡图予以显示。

1.8 麻黄附子细辛汤关键活性成分-哮喘靶点的KEGG 通路

将通过文献分析获取的与KEGG 有关的信号通路及关键活性成分，导入Cytoscape 3.7.2，构建麻黄附子细辛汤关键活性成分-哮喘靶点的KEGG 通路。

2 结果

2.1 活性成分

筛选得到麻黄、附子、细辛中的活性成分，包括共有成分，共32 种，口服生物利用度排名前5 位的主要活性成分为槲皮素、木犀草素、山柰酚、β-谷甾醇、柚皮素。

2.2 药物与疾病靶点维恩图建立

将“2.1”中活性成分经标准化处理后得到234 个靶基因。将在毒性与基因比较数据库中检索筛选到的486 个哮喘靶基因与麻黄附子细辛汤的靶基因构建维恩图，获得110 个麻黄附子细辛汤治疗哮喘的共同靶基因。见图1。

图1 麻黄附子细辛汤-哮喘靶基因维恩图

2.3 关键靶点的筛选及PPI 分析

取度值、中介中心性、接近中心性平均值以上的靶基因作为关键靶点，在110 个靶点中得到TP53、肿瘤坏死因子等30 个靶点，预测这些靶点是麻黄附子细辛汤治疗哮喘的关键靶基因。将药物与疾病的共同治疗靶点导入STRING 数据库中，得到药物-疾病靶点PPI 网络图。见图2。

图2 药物-疾病靶点蛋白质-蛋白质相互作用网络图

2.4 KEGG 信号通路分析与GO 富集分析

将30 个关键靶点导入人类基因组注释数据库中，得到15 条与哮喘相关的KEGG 信号通路，并绘制气泡图。见图3。GO 富集显示生物过程124 个，分子功能24 个，细胞组成12 个。富集结果以数量值前5 位予以展示，见图4。

图4 GO 富集分析条形图

2.5 麻黄附子细辛汤关键活性成分-核心靶点-疾病信号通路

利用Cytoscape 3.7.2 以槲皮素、木犀草素、山奈酚、柚皮素、β-谷甾醇为主要成分构建麻黄附子细辛汤关键活性成分-核心靶点-疾病信号通路图，见图5。图中长方形代表核心靶点，箭头代表活性成分，椭圆形代表信号通路，菱形代表疾病。

图5 麻黄附子细辛汤关键活性成分-核心靶点-疾病信号通路

3 讨论

3.1 关键活性成分分析

中医理论认为，哮喘的发生与脾、肺、肾之间的关系最为密切。在肺虚中，患者表现出营卫不固，御外无力，易感外邪，免疫力下降；脾虚则表现出免疫系统的功能紊乱和低下；肾虚中，患者表现出下丘脑、垂体、肾上腺和内分泌的功能发生紊乱或者低下[3]。中医认为补虚固本，理气祛痰是治疗哮喘的关键[4]。槲皮素是一种植物衍生的黄酮类化合物，具有广泛的抗炎、抗氧化应激以及免疫调节作用[5]。Park 等[6]发现槲皮素可通过调节哮喘小鼠的T-bet 和GATA-3 基因的表达，抑制Th2 型细胞因子表达，促进Th1 型细胞因子γ 干扰素的表达，从而减轻哮喘小鼠气道高反应性。木犀草素属于天然的黄酮类化合物，可抑制Th2 型细胞因子的合成[7]，故其具有抗氧化、抗过敏、免疫调节等作用。Jang 等[8]研究证实，通过抑制Th2 细胞因子，木犀草素可以对过敏性哮喘发挥治疗作用。山柰酚同样属于黄酮类化合物，也具有抗癌、抗炎、抗病毒等功能。柚皮素属于二氢黄酮类化合物，史莹等[9]在细胞实验中研究证明，柚皮素在体外可以抑制与哮喘病理发生有关的炎症因子。β-谷甾醇是植物甾醇类成分之一，研究表明，β-谷甾醇具有抗哮喘作用[10]。

3.2 关键靶基因分析

为深入研究麻黄附子细辛汤治疗哮喘的作用机制，本研究筛选出30 个关键靶基因。其中TP53 对促进凋亡[11]和抗炎应答[12]起到调节作用，从而参与哮喘发生和全过程，基质金属蛋白酶2、9 是参与哮喘炎症反应的过程，与哮喘的气道重塑有关[13-14]。肿瘤坏死因子基因可激活单核巨噬细胞，产生炎症介质[15]，白细胞介素-6 为重要的炎症因子，主要由上皮细胞，T、B 细胞，单核巨噬细胞等产生[16-17]，在发生哮喘时增高，病情缓解后渐渐恢复到正常水平，参与哮喘的全过程[18-19]。Lee 等[20]实验证明，CCL2 基因在小鼠过敏哮喘模型的支气管上皮细胞中表达显著。AKT1 是通过影响炎症因子白细胞介素-1β 的表达，从而参与哮喘的过程[21]。PPARG 可通过调节炎症在哮喘中起作用[22]。FOS 和JUN 可促进哮喘中黏附分子的增值[23-24]。

3.3 KEGG 通路分析

对核心靶点进行KEGG 通路富集分析，进一步研究麻黄附子细辛汤治疗哮喘的作用机制，与哮喘密切相关KEGG 信号通路有：肿瘤坏死因子信号通路、Toll样受体信号通路等15 个信号通路。Zhang 等[25]研究发现，肿瘤坏死因子通过负反馈调节Th2 细胞功能，介导细胞免疫、炎症反应等过程，在治疗哮喘的过程中发挥作用。哮喘的易感性也可能与先天免疫成分编码基因的变异有关，病原体通过Toll 样受体激活气道上皮的先天性免疫反应,诱发气道炎症，继而导致哮喘急性加重，使其成为哮喘的生物学候选基因[26]。FoxO信号通路是氧化还原的重要转录通路，参与细胞的氧化、还原、凋亡的全过程，但少有文献报道其与哮喘之间的关系。磷脂酰肌醇3 激酶主要表现在细胞增殖方面，Akt 激酶可以调节细胞的增殖和代谢，阻断该信号通路可以改变气道结构，减轻气道重塑，调节细胞分化及炎症因子的产生，从而治愈哮喘[27]。

综上，本研究通过网络药理学的方法对麻黄附子细辛汤治疗哮喘的作用机制进行初步讨论，为临床实验提供了理论依据，为进一步的试验提供了可能性。