基于网络药理学和分子对接探讨杜仲-淫羊藿-骨碎补组方治疗骨质疏松症的作用机制

吴 鹏 李 莎 时孝晴 廖太阳 陈巨鹏

南京中医药大学附属医院骨伤科，江苏南京 210029

骨质疏松症（osteoporosis，OP）是一种骨量低下、骨微结构受到损坏，脆性增加的全身性疾病[1]。目前，西医对OP 的治疗主要以促进骨形成和抑制骨吸收为主，大多药物治疗较为局限，具有一定副作用，而且价格较为昂贵[2]。中医药治疗OP 效果确切、患者依从性较好，在OP 的治疗中占据十分重要的位置[3]。杜仲-淫羊藿-骨碎补（eucommia ulmoides-epimediumrhizoma drynariae，DYG）一直都是中医药治疗OP 的核心药物，也是南京中医药大学附属医院经典名方—补肾活血健骨方的主要组成成分[4-5]，但其治疗OP 的主要成分及作用机制尚不明确。

网络药理学能够通过分析“药物-基因-蛋白”的相互作用网络，系统地揭示药物与疾病的相关性[6-7]。本研究基于网络药理学和分子对接，探讨DYG 治疗OP 的潜在机制，为其治疗OP 提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 筛选DYG 活性成分与作用靶点

通过检索中药系统药理学数据库和分析平台（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）获取杜仲、淫羊藿、骨碎补的活性成分，根据成分药物代谢动力学吸收、分布、代谢、排泄参数进行筛选，条件设置如下：药物口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，药物相似性（drug-likeness，DL）≥0.18，联合Perl 语言与Uniprot 数 据 库（https：//www.uniprot.org/uniprot/）筛 选出DYG 的相关靶点[8]。

1.2 OP 靶点查询与筛选

以“Osteoporosis”为关键 词 在GeneCard、OMIM、PharmGkb、Therapeutic Targets 和DrugBank 数据库检索与OP 相关的基因。将药物活性成分与疾病相关的靶点进行映射，筛选出共同靶点，绘制维恩图。

1.3 构建DYG 与OP 作用靶点网络

将筛选得到的DYG 活性成分和OP 相关靶点筛选结果导入Cytoscape 软件构建DYG 活性成分与OP靶点网络。使用Cytoscape 软件NetworkAnalyzer 工具计算网络相关属性。

1.4 构建蛋白质-蛋白质相互作用（protein protein interaction，PPI）及筛选核心靶点

将药物-疾病共同靶点导入STRING 数据库（https：//string-db.org/），设置物种：Homo sapiens，置信度：0.4，保存PPI 图。将PPI 数据导入Cytoscape 软件，借助CytoNCA 插件，根据度中心性（degree centrality，DC）、介数中心度（betweenness centrality，BC）、接近中心性（closeness centrality，CC）、特征向量中心度（eigenvector centrality，EC）、局部边连通性（local average connectivity，LAC）、网络中心性（network centrality，NC）等参数进行拓扑分析。将上述参数的拓扑分析结果取两次中间值，最终获得的节点为核心靶点。

1.5 GO 功能富集分析和KEGG 信号通路分析

GO 功能富集分析用来对DYG 治疗OP 的分子功 能（molecular function，MF）、生物 过 程（biological process，BP）和细 胞成 分（cellular components，CC）进行注释。KEGG 信号通路分析用来预测DYG 治疗OP的相关通路，选择富集程度最高的前20 项。

1.6 分子对接

使用Discovery Studio 2016 进行分子对接。DYG类药成分与OP 作用靶点分别通过Chemical Book 数据库和PCSB PDB 数据库获取。将上述获得的靶蛋白进行去水、加氢等处理，保存为对接受体。使用Lib-Dock 模块进行分子对接。LibDock score 评价活性成分和关键靶点之间的对接效应，分数越高提示配体与受体蛋白结合性越好。

2 结果

2.1 DYG 活性成分

通过检索TCMSP 数据库，设置OB 和DL 等参数初步筛选到生物活性成分75 个，删除重复及无效活性成分，最终得到38 个有效活性成分。

2.2 构建DYG 活性成分与OP 作用靶点

检索TCMSP 数据库中成分靶点，删除无效与重复的靶点，最终得到168 个活性成分作用靶标，在GeneCard、OMIM、PharmGkb、Therapeutic Targets 和Drug Bank 数据库中检索到4547 个与OP 相关靶点，映射后得到121 个共同靶基因。见图1。

图1 DYG 成分与OP 靶点维恩图

2.3 构建DYG 活性成分与OP 靶点网络

将38 种活性成分与121 个OP 相关作用靶点进行映射后导入Cytoscape 构建DYG 成分-OP 靶点网络，见图2。使用NetworkAnalyzer 工具对网络图进行统计，得出各节点的degree 值。结果显示，活性成分中kaempferol（degree=124）的连接度靠前。

图2 DYG 成分OP 靶点网络

2.4 核心靶点筛选

将121 个关键靶标导入STRING 数据库，PPI 网络显示其中162 个节点，638 条边，见图3。将TSV 数据导入Cytoscape，基于DC、BC、CC、EC、LAC、NC，使用CytoNCA 对上述数据进行分析。最终得到IL-1β、MMP9、MAPK8、CXCL8、VEGFA、PTGS2、JUN、IL-6、MAPK1、EGF、AKT1 为核心靶点，见图4。

图3 DYG 靶点PPI 网络

图4 DYG 治疗OP 潜在核心靶点

2.5 GO 功能富集分析和KEGG 通路分析

GO 富集分析显示生物过程主要涉及磷酸酶结合、酰胺结合、核受体活动等，见图5。KEGG 通路分析显示潜在信号通路主要包括AGE-RAGE、细胞凋亡、IL-17、TNF 等信号通路，见图6。

图5 DYG 活性成分潜在治疗OP 靶点的GO 功能分析

2.6 分子对接分析

本研究对核心靶点与所有活性成分都进行了分子对接，由于kaempferol 的degree 值最高，所以进行了代表性展示。结果显示DYG 活性成分kaempferol与IL -6、EGF、JUN、MAPK8、CXCL8、MMP9、MAPK1、IL-1β 均能较好对接。对接过程见图7，配对结果见表1。

表1 kaempferol 与OP 靶受体蛋白分子对接情况

图7 DYG 活性成分kaempferol 和OP 核心靶点对接过程

3 讨论

OP 属于中医“骨痿”“骨枯”范畴。《素问·痿论篇》中：“肾主身之骨髓……肾气热，则腰脊不举，骨枯而髓减，发为骨痿。”《诸病源候论·卷三·虚劳病诸候》记载：“肝主筋而藏血，肾主骨而生髓。虚劳损血耗髓，故伤筋骨也。”表明大多医家认为OP 的发生多与脾肾亏虚、肝郁气滞血瘀密切相关，“虚”为本，瘀为“标”[9-10]。

杜仲、淫羊藿和骨碎补已被广泛运用于OP 的治疗。马定耀等[11]研究结果显示，骨碎补、淫羊藿配伍杜仲能显著提高OP 患者的骨密度，缓解疼痛。赖满香等[12]基于中医传承辅助系统对治疗原发性OP 的相关方剂组方规律进行了相关分析，结果显示淫羊藿、杜仲、补骨脂组合在相关治疗OP 的方剂中使用达16 次，杜仲、淫羊藿和骨碎补在相关处方中使用频数分别达到52、46、41 次。赵亮等[13]研究结果显示，给予去卵巢OP 大鼠6 g/kg 盐灸杜仲能够促进成骨细胞分化，抑制骨吸收。朱贵忱等[14]发现淫羊藿联合钙尔奇D 较单独口服钙尔奇D 更能显著缩短OP 患者腰背部疼痛时间，增加骨密度。李展春等[15]发现骨碎补能够改善OP 大鼠骨微结构，提高生物力学性能。

本研究筛选出了DYG 的38 个活性成分，其中骨碎补的有效成分柚皮素能够上调Bcl-2 表达、下调Bax、Caspase-3 表达抑制成骨细胞凋亡[16]。骨碎补总黄酮能够促进大鼠成骨细胞内VEGF 和成纤维细胞生长因子2（FGF-2）的表达，促进血管新生，有助于成骨细胞的增殖和分化[17]。淫羊藿苷能够激活成骨细胞内cAMP-PKA 信号通路，显著增加碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、Ⅰ型胶原和Runx-2 的表达促进成骨细胞的增殖[18-19]。杜仲总苷能显著提升去睾丸大鼠骨密度和ALP 的浓度[20]。杜仲乙醇提取物能够促进成骨细胞增殖，间接抑制破骨细胞分化[21]。在11 个防治OP 的作用靶点中有8 个相关蛋白最终成功分子对接。IL-1β 能够调节骨重吸收，刺激成骨细胞产生IL-6 和TNF，相互协调共同促进骨吸收。IL-6 能够诱导破骨细胞活化，增加活性，抑制凋亡，延长寿命。EGF 可以作用于骨吸收和骨形成，能够激活破骨细胞，抑制其相关功能[22]。MMP9 与破骨细胞分解骨基质有机成分能力密切相关，是破骨细胞骨吸收的重要标志物[23]。MAPK8 能够调节细胞的分化、增殖和存亡。MAPK1 可以通过促进成骨细胞的增殖，增加成骨能力。CXCL8 和JNK 均能加剧炎症反应[24-26]。

本研究基于网络药理学和分子对接对DYG 治疗OP 的作用机制进行了相关分析，通过GO 功能富集分析和KEGG 通路分析，初步推测DYG 可能通过相关有效活性成分调控IL-6、EGF、JUN、MAPK8、CXCL8、MMP9、MAPK1、IL-1β 等靶点调节AGE-RAGE、细胞凋亡、IL-17、TNF 等信号通路，抑制破骨细胞的生成，刺激成骨细胞生长，调节骨代谢平衡，抑制相关炎症因子。本研究初步阐释了DYG 多靶点，多通路治疗OP，为DYG 治疗OP 提供了科学依据和新的方向。